[发明专利]一种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用。本发明所述培养方法先采集外周血，分离出血浆和外周血单个核细胞；将外周血单个核细胞用含所述血浆的M199培养基进行重悬，然后加入EGF因子培养3‑5天；去掉未贴壁的悬浮细胞，更换前述添加了血浆和EGF因子的M199培养基继续培养；当细胞达到80％‑90％融合时，消化细胞，获得培养后的PB‑MSC。本发明将从外周血分离出的外周血单个核细胞以有别于传统方式的不同培养基进行有效培养，避免采用动员剂，保证了培养后的PB‑MSC数量，同时提供了PB‑MSC在抗皮肤衰老中的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源细胞之一，是近期研究的热点。大量研究证实，MSC可以从骨髓分离得到，但也存在于其他不同组织和脏器，如肌肉、脂肪组织、脐血、胎盘、血管等，不同来源的MSC在生物活性和作用原理上上都存在或多或少的差异。

外周血间充质干细胞(PB-MSC)是从人外周血中分离得到的间充质干细胞。它们的形态、表面标记及其分化潜能与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)相似。目前对MSC的研究主要集中在骨髓、脂肪、脐带、脐血等方面，但是其应用于临床最大的瓶颈是取材过程中会使供者产生创伤性，存在并发症、得到的MSC的数量也较少(1×10⁴cells/ml-5×10⁴cells/ml)，并且BM-MSC在体外培养时其生物学特性会发生一定程度的改变和转化。

对于外周血中MSC来说，相对研究的较少，这主要是因为PB-MSC在外周血中的含量少，分离提取和纯化培养相对困难，且对操作和实验室条件都有一定的要求。但是相比骨髓、脂肪组织、胎盘等这些创伤较大的MSC来源，外周血中的MSC采集简单，创伤小，不受时间的限制，且具有多向分化的能力。如果能建立起有效的分离和扩增体系，外周血作为一种可供选择的MSC来源，用于细胞治疗和再生医学领域，将具有非常广阔的临床应用前景。

为了解决PB-MSC含量少的问题，有采用G-CSF来提高PB-MSC在外周血中的含量。G-CSF，人类粒细胞集落刺激因子，它是一个膜转运蛋白，通过影响骨髓基质微环境的粘附分子表达或功能状态，降低干细胞与骨髓基质的粘附作用，使干细胞脱离骨髓，进入外周血循环。

现有技术中，血液采集前需对供者注射G-CSF动员剂进行动员，连续5天动员后再采集血液，采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，分离人外周血单个核细胞(PBMC)，再用DMEM/F12培养基加上10％的胎牛血清培养PB-MSC，贴壁培养1～2天后即去掉悬浮细胞得到贴壁细胞。尽管动员后会得到相对较多的PB-MSC，但是同时也将得到更多的其他血系细胞，PB-MSC的分离和纯化带来新的问题和挑战，且经过培养后得到的贴壁细胞中只有很少比例的PB-MSC，一般为5％～30％。且使用动员剂后，对供者的副作用明显，因此不是最佳的采集和培养PB-MSC的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用，使得所述培养方法在不使用动员剂的前提下提高PB-MSC的数量，同时可以应用到抗皮肤衰老的美容中。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种人外周血间充质干细胞的培养方法，包括：

步骤1、采集外周血，分离出血浆和外周血单个核细胞；

步骤2、将外周血单个核细胞用含步骤1所述血浆的M199培养基进行重悬，然后加入EGF因子培养3-5天；