[发明专利]一种高产胞外多糖的基因工程菌及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种高产胞外多糖的基因工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类公认的具有较高经济价值的食品级微生物，其作为人和动物体内重要的正常生理菌群，常定殖于肠道等部位，起到维持体内微生态平衡和健康的作用，已广泛应用于食品、轻工业、医药、饲料等多个领域。乳酸菌胞外多糖(Exo poly saccharide，EPS)是在生长代谢过程中分泌到细胞壁外，常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜多糖，有的则进入培养基中形成粘液多糖。不同的乳酸菌能产生多种化学组成和分子结构不同的胞外多糖，它们不但具有增稠、乳化、保湿和稳定等功能特性，而且还具有增强粘膜吸附作用、抗肿瘤、抗溃疡、免疫激活以及降低胆固醇等生理功能，因而近年来对其开展的研究较多。另外，乳酸菌是一般认为安全(generally recognized as safe，GRAS)的食品级微生物，EPS作为其重要的次生代谢产物，具有很高的研究和利用价值。20世纪40年代开发出的由肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)产生的右旋糖酐(dextrans)是最早被开发利用的乳酸菌胞外多糖，也是食品和药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的第一种食品级微生物胞外多糖。至今，人们已经筛选出了多株产EPS的LAB。然而乳酸菌胞外多糖的产量低，制约着它的大规模工业化应用。目前，对于培养基、培养条件、生长因子等外部因素影响EPS合成量的报道已经很多，而从LAB的遗传和生理角度对其EPS合成量影响的报道甚是少见。随着对EPS生物合成途径研究的增多和分子生物学技术的迅速发展，越来越多的学者期望利用基因工程方法调控多糖合成代谢来改变多糖的产量和结构。干酪乳杆菌LC2W(CGMCC No.0828)是本实验室前期分离得到的一株功能性益生菌，其发酵液中具有能够降低血压的胞外多糖成分，然而该菌株的胞外多糖产量较低，不能满足工业化生产的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中乳酸菌胞外多糖产量不高，调控机理不明等问题，提供一种高产胞外多糖的基因工程菌及其制备方法和应用，以及利用所述基因工程菌制备胞外多糖的方法及其产品。

本发明人发现，由于乳酸菌胞外多糖的产量低，制约着它的大规模工业化应用。目前，对于培养基、培养条件、生长因子等外部因素影响EPS合成量的报道已经很多，而从LAB的遗传和生理角度对其EPS合成量影响的报道非常少见。随着对EPS生物合成途径研究的增多和分子生物学技术的迅速发展，越来越多的学者期望利用基因工程方法调控多糖合成代谢来改变多糖的产量和结构。

因此，为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种高产胞外多糖的基因工程菌，其是在产胞外多糖的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)中过表达nox基因的基因工程菌。

本发明所述的产胞外多糖的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)为本领域常规的干酪乳杆菌，只要该干酪乳杆菌能够产生胞外多糖即可。所述产胞外多糖的干酪乳杆菌菌株较佳地为干酪乳杆菌LC2W，该菌株的保藏编号为CGMCC No.0828。本发明所述的表达载体为本领域常规的表达载体，只要在宿主菌中能够过表达所述外源基因nox即可，所述表达载体较佳地包括各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，更佳地为pIB184质粒。

本发明所述重组表达载体的构建方法为本领域常规质粒克隆方法。所述克隆方法较佳地包括以下步骤：将本发明所述nox基因的核酸分子与表达载体pIB184质粒分别用限制性内切酶SacⅠ和BamHⅠ双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明所述重组表达载体，将所得重组表达载体命名为pIB184-nox。