[发明专利]一种快速高通量的疟原虫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种快速高通量的疟原虫检测方法。

背景技术

疟疾是最严重的全球性公共健康问题之一，世界上超过一半的人口生活在疟疾流行区。近年来我国输入性疟疾呈逐年上升趋势，感染人类的疟原虫有4种：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum,P.f)、间日疟原虫(Plasmodium vivax,P.v)、三日疟原虫(Plasmodium malariae,P.m)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale,P.o)。因此，有效的检测疟原虫是医学诊断和疟疾防治必不可少的手段。目前我国仍采用显微镜检法作为诊断疟疾的“金标准”，显微镜检法受镜检人员的主观判断及责任心影响，极容易漏诊，延误治疗。为提升对疟疾病例的实验室复核和确诊能力，近年来以PCR为基础的分子生物学诊断技术发展迅速。污染风险低、灵敏度及特异性高的Real-time PCR需要昂贵的仪器及试剂，难以在基层疾控部门推广。

以PCR技术为代表的分子生物学手段是现在广泛应用于疟原虫快速检测的技术。而由PCR技术发展起来的实时荧光PCR技术以及基因芯片技术等是目前在疟原虫检测中使用最广泛的分子生物学方法。实时荧光PCR技术是一种新的PCR方法，是在常规PCR反应的基础上增加了能与扩增模板特异性结合的探针，与传统PCR相比，该方法无需对PCR产物进行再处理，完全是在封闭状态下完成检测的全过程，具有实时、准确、快速等特点，但是由于对设备要求较高，对工作人员的操作技术难度大，所以不适合快速，准确的检测。

基因芯片是20世纪90年代发展起来的全新的微量分析技术，它采用微加工和微电子技术将大量的人工设计好的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上而得到的一种信息检测芯片。基因芯片可以同时固定大量的探针分子，理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病原，也可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标，这为平行检测多个菌种或同菌种内多个菌株提供了一条便捷的途径；同时检测的灵敏度、特异性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析检测中有很好的发展前景。

基因芯片技术利用待检测样品的基因组序列设计针对各种微生物的特异探针，将该探针(寡核苷酸)点样于芯片表面，同时在探针两侧设计PCR引物，在引物合成过程中对其5’端进行荧光标记或在PCR过程中加入荧光标记的dNTP，这样利用PCR扩增的方法即可得到标记有荧光染料的待检测靶标，然后用含有待检测样品特异探针的微阵列芯片与标记的靶标杂交，荧光标记的DNA分子与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光信号，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定疟原虫。

当前用于疟原虫检测的基因芯片检测已经有些应用于研究，但是这些基因芯片的探针点样多采用手工模式，操作复杂，并且增加了很多假阳性的机会。

本发明整合了聚合酶链式反应(PCR)和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上。PCR反应结束后可以直接加入杂交液进行杂交，操作简单，节省时间，另外灵敏度可以达到几十个Copy的DNA分子。

本发明的检测方法可运用于三种疟原虫快速灵敏的检测，作为血清学试验及镜检法的可靠补充，提高检测的准确性和时效性，可大大地降低检测的周期。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速高通量的疟原虫检测方法，本发明能对恶性疟、间日疟、三日疟原虫基因进行快速灵敏的检测，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止疫情的发生和国外疟疾的传入。

本发明针对恶性疟、间日疟、三日疟原虫特有基因，设计引物，在引物扩增区内设计能够区别其他疟原虫及亲缘关系较近的物种的特异性探针，通过探针特异性验证、探针灵敏度实验、方法特异性实验等证明该方法可以特异检测恶性疟原虫，与常规PCR方法比较，检测灵敏度明显高于常规方法多重PCR扩增产物的检测最低检出限，不仅可以满足日常疫情安全检测的要求，甚至可以满足临床样品的检测要求。

本发明所提供的快速高通量疟原虫检测方法，包括如下步骤：

(1)血液样本DNA液提取；

(2)PCR扩增：

a.PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液,待测样本基因特异性正、反向引物，PCR Grade H₂O,PCR Control,DNA提取液；