[发明专利]一种利用定点切割系统对猪H11位点定点插入的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用定点切割系统对猪H11位点定点插入方法以及所设计的打靶载体。

背景技术

已知在生物技术研究中，将目的基因插入到染色体基因组中，可以采用同源重组的办法或使用转座子的办法，但实践表明，同源重组的效率较低，操作麻烦，并且由于目的基因的插入而使原有的基因遭受破坏；使用转座子的方法，也存在插入到染色体的部位是随机的，而且使用的操作转座酶价格昂贵。

因此，由于上述技术使用的局限性，在培育猪的优良品种时，主要采用随机整合的方式使外源基因随机插入猪基因组中，相应的使用该技术得到的重组体是后续的繁育与表型分析非常繁琐。

2010年，斯坦福大学的Simon Hippenmeyer及其研究团队在小鼠的第11号染色体上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hipp11位点，简称H11位点。H11位点位于Eif4enif1与Drg1两个基因的间隙，与Eif4enif1基因的19号外显子和Drg1基因的9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hipp11位点定点基因修饰的小鼠与野生型小鼠生长发育无区别。目前类似的还有Rosa26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，然而H11位点则不存在类似的困难，由于其位于两基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hipp11这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。

ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，而CRISPR/Cas9系统对特异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有 一系列的crRNA组成，每个针对特异位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种借助定点切割系统对猪H11位点定点插入的方法，以解决目前的技术随机插入、步骤繁琐、价格昂贵等缺陷。

为实现上述目的，本发明所提供的方法包括以下步骤：1)设计被敲除基因的5’端同源臂和3’端同源臂以及相应的通用引物；2)将上述同源臂、通用引物和/或欲插入的基因引入到载体中，得到打靶载体；3)转染细胞；4)PCR扩增鉴定插入结果。

其中，上述的5’端同源臂的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

其中，上述的5’端同源臂的通用引物核苷酸序列如序列表中序列2所示。

其中，上述的3’端同源臂的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。

其中，上述的3’端同源臂的通用引物核苷酸序列如序列表中序列4所示。

其中，上述步骤4)中所用到的PCR扩增引物的核苷酸序列如序列表中序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10所示。

本发明的另一个目的是提供了一种打靶载体，该载体是依托CRISPR/Cas9打靶系统所设计，它能够将外源基因精确的引入到猪的H11位点中，以解决传统打靶技术效率低下，PCR检测引物不便设计，检测难度大的问题。

为实现上述目的，本发明提供的打靶载体序列包括上述的5’端同源臂序列、5’端同源臂通用引物序列、欲插入的基因序列、3’端同源臂通用引物序列、3’端同源臂序列。

可进一步优化为，上述打靶载体还可以包括筛选元件Neo基因序列和/或DTA基因序列。

上述打靶载体中还可以不包含筛选元件。

进一步的，其核苷酸序列如序列表中的序列11所示。

本发明的再一个目的是将上述重组质粒应用到构建猪定点突变库的构建上。