[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，其包含缓冲剂、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、MgSO₄、AMV反转录酶、钙黄绿素、MnCl₂、抑制剂和以下6条引物：

F3  GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA

B3  GTTACCCGAACCTGTAGGCT

F1C GCTATCGCATGGTGAAGG

F2  CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC

B1C CAAGTTGAAATTCGCCTGG

B2  ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG。

2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，其包含10×Bst缓冲剂2.5μL、Bst DNA聚合酶8U、10mmol/L dNTPs 3.5μL、1mol/L甜菜碱3μL、100mmol/L MgSO₄0.5μL、5U/μL AMV反转录酶0.5μL、250μmol/L钙黄绿素3μL、25mmol/L MnCl₂0.5μL、40U/μL抑制剂1.5μL、40μmol/L F1C 0.5μL、40μmol/L B1C 0.5μL、20μmol/L B30.25μL、20μmol/L F30.25μL、20μmol/L F20.85μL、20μmol/L B20.85μL。

3.一种猪流行性腹泻病毒S基因非诊断性RT-LAMP检测方法，其包括以下步骤：

1)PEDV的繁殖与收获步骤：传代培养Vero细胞PEDV，待其长成单层后，将PEDV冻干毒用DMEM稀释后接种于Vero细胞上，经过培养至出现明显病变后刮取细胞收获病毒液；

2)病毒RNA的提取步骤：采用TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒在上述病毒液中提取PEDV病毒RNA；

3)引物的设计与合成的步骤：根据GenBank中PEDV S基因的保守区域设计6条LAMP引物，6条引物序列为：

F3  GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA

B3  GTTACCCGAACCTGTAGGCT

F1C GCTATCGCATGGTGAAGG

F2  CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC

B1C CAAGTTGAAATTCGCCTGG

B2  ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG；

4)配制RT-LAMP恒温反应体系的步骤：按照权利要求2配制RT-LAMP恒温反应体系；

5)RT-LAMP反应：以步骤3)提取的RNA为模板，加入到在上述RT-LAMP恒温反应体系中进行反应；其中RNA模板量为2μL，并用去离子水补足至25μL；

6)可视化观察RT-LAMP反应记过，并对其结果进行验证。

4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒S基因非诊断性RT-LAMP检测方法，其特征在于：步骤1)中接Vero细胞后于37℃5％CO₂培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于培养箱中培养至出现明显病变后刮取细胞收获病毒液。