[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测方法技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来，仔猪腹泻呈多发性趋势，因其传播速度快、治愈率低、死亡率高等特点，严重制约生猪养殖业的健康发展。腹泻病毒感染是导致仔猪腹泻最重要的原因之一。许多病毒可致仔猪腹泻，如诺如病毒、博卡病毒、星状病毒等，但最常见、危害最深的是猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒，而又以后者为重。

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的急性、接触性、高度传染性的消化道疾病，不同品种、年龄的猪只都可感染发病，尤以7日龄内仔猪易感性最强，患猪主要症状为呕吐、水样腹泻和脱水等，该病感染率为100％，死亡率一般为80％-100％，波及范围广，呈世界范围内存在，给畜牧业生产带来巨大的经济损失。另外，病原基因型多，而且与传染性胃肠炎和轮状病毒病的临床症状、流行特点和病理变化都极其相似，但从临床症状方面很难进行有效地鉴别诊断，而现行的多数实验室诊断方法存在诸多弊端，故建立适合猪场和基层实验室使用的、快速准确的诊断方法对于发现、确诊、监测和防控该病意义重大。

目前，PEDV的常规监测方法主要有病原学检测，包括：病毒的分离鉴定和电镜检测；免疫学方法，包括：免疫荧光法、血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)，等；分子生物学技术，包括：核酸探针杂交，反转录-聚合酶链反(RT-PCR反应)，套式PCR，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)，多重PCR，等。作为传统的检测方法，PEDV的病原学检测存和血清学检测存在着许多不足。

PEDV的分离鉴定和电镜观察只能在高水平的实验室中由专业的技术人员操作，所需周期长，分离难度大；电镜观察病毒方法证明，在任何PEDV感染猪的肠内容物和粪便中可以发现有TGEV的存在，非特异性极低；PEDV抗体的血清学方法检测，最常用的是SN试验，技术复杂，操作繁琐，成本极高；酶联免疫吸附实验(ELISA)是当前应用最广泛的一种免疫学检测方法，但由于单克隆抗体是针对特定抗原位点，而不同PEDV株这些抗原位点有差异，导致某些样品的漏检。分子诊断技术的蓬勃发展给PEDV的检测提供了更多的方法，如RT-PCR、基因芯片技术、实时荧光RT-PCR等，但由于试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高等，因此，建立一种快速简便的、适用于临床和基层实验室的检测方法十分重要。

环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是Notomi等设计并应用的，针对靶基因的不同区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，于恒温条件下快速完成核酸的扩增反应，最主要的特点是：四种引物在靶基因上的不同部位完全匹配才能进行扩增，具有很高特异性；等温扩增，省去了昂贵的热循环仪的费用；多引物且不用控制温度变化促使链置换反应使靶基因利用酶反应系统搞笑扩增，靶核酸序列呈指数扩增，扩增效率高。

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)是在LAMP反应体系中加入一定量的逆转录酶从而实现RNA到DNA的一步扩增，不需要模板的热变性、退火和长时间温度循环等过程，只需要恒温几十分钟即可完成，且扩增效率极高，一般能检测到10拷贝以下的样品，故该方法具有高特异性和高敏感性的特点，对于低浓度的病毒或无症状的病毒携带者的检测敏感性也非常较高。RT-LAMP法的结果判定方法有肉眼观察沉淀法、荧光染料显色观察法、琼脂糖凝胶电泳法和浊度仪检测法四种。随着科学的发展，在反应体系中添加染料，通过产物与染料的作用而使体系颜色发生变化以确定反应发生的发生越来越被接受和使用，而SYBR Green I和Green Finder因假阳性和无特异性而备受诟病。