[发明专利]一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途有效

专利信息
申请号: 201410712363.8 申请日: 2014-11-28
公开(公告)号: CN104404049A 公开(公告)日: 2015-03-11
发明(设计)人: 李钢;邹辉琴;高静雷;温静 申请(专利权)人: 四川华德生物工程有限公司
主分类号: C12N15/12 分类号: C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/435;C12P21/02;A23K1/17;A61K38/17;A61P31/00
代理公司: 成都高远知识产权代理事务所(普通合伙) 51222 代理人: 李高峡;张娟
地址: 610041 四*** 国省代码: 四川;51
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摘要:
搜索关键词: 一种 防御 突变体 及其 制备 方法 用途
【说明书】:

技术领域

发明涉及基因工程领域,具体涉及一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途。

背景技术

抗菌肽(Antibacterial Peptides,ABPs),又称抗微生物肽(Antimicrobial Peptides,AMPs),广义上是指广泛存在于生物体内具有抵御外界微生物侵害,清除体内突变细胞的一类小分子多肽,是生物先天免疫防御系统的一个重要组成部分,在黏膜免疫系统中起重要作用,称之为“第一道防御体系”或“第一道免疫体系”。抗菌肽广泛存在于细菌、植物、无脊椎动物及脊椎动物体内,不仅具有广谱抗细菌能力,而且对真菌、病毒及癌细胞也有一定杀抑作用。此外,还具有稳定、水溶性好、抗菌机理独特、无耐药性、对高等动物正常细胞无害等特点,从而显示了其在医学和农业上潜在的研究和应用价值。

蝇防御素是来自于家蝇的抗菌肽,其杀菌机制是分子中的二硫键与细菌细胞膜的磷脂有很强的亲和作用,即大量分子与膜结合在一起,形成寡聚糖体,并在细菌细胞膜上围成一个离子通道,使细胞内大量K+外流和ATP合成受阻,导致细胞呼吸停止、菌体死亡。研究也发现,防御素附着在细菌表面后,除了本身对细菌的损伤外,还可以使细菌被吞噬细胞吞噬消化,起到调理素的作用。

直接从家蝇中分离提取的蝇防御素难以满足市场需求,采用基因工程的方式制备重组蝇防御素可以降低成本,但是采用蝇防御素的基因直接在大肠杆菌中表达获得的重组蝇防御素抗菌活性不高,耐热活性差,不具备抗胰蛋白酶的活性,实际应用价值低。

发明内容

为了解决上述问题,本发明提供了一种蝇防御素的突变体。

本发明提供了一种如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

还提供了一种重组载体,它包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。优选地,所述的重组载体是重组pGEX-4-1质粒。

还提供了一种重组菌,它包含前述的重组载体。优选地,所述的重组菌为重组大肠杆菌。

本发明蝇防御素突变体,它由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种制备前述蝇防御素突变体的方法,包含如下步骤:

(1)取前述的重组菌,接种于含有50ug/mL氨苄青霉素的液体肉汤培养基中,37℃、220rpm震荡培养12h,然后用含有50ug/mL的氨苄青霉素的液体肉汤培养基重悬至OD600为0.1,于37℃培养至OD600为0.8,加入IPTG至终浓度为1mM,诱导表达3小时,离心,得菌体;

(2)取菌体,用GST融合蛋白纯化试剂盒分离纯化,得到结合了GST融合蛋白的树脂后,加入等体积的浓度为50U/ml的凝血酶溶液,混匀,室温震荡10小时,离心,得上清,去除凝血酶,即得。

所述液体肉汤培养基每升包含如下成分:蛋白胨10g、酵母浸出物5g、NaCl 10g,其余为水。

本发明还提供了前述蝇防御素突变体在制备饲料添加剂或抗菌药物中的用途。

本发明还提供了一种抗菌药物,它是以前述蝇防御素突变体为活性成分,加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明通过基因工程的方式制备得到了纯品蝇防御素突变体,其抑菌活性好,耐热活性佳,具备抗胰蛋白酶的活性,具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1 SDS—PAGE分析。1泳道为纯化LUC-ori融合蛋白;2泳道为纯化的LUC-n融合蛋白;9泳道为LUC-n菌悬液总蛋白;8泳道为细胞溶解后上清蛋白;7泳道为溶菌酶,DNA酶,RNA酶酶解后上清;6泳道为酶解后沉淀总蛋白;4,5泳道为上柱前清液,3为第一次洗柱清液。

图2 SDS—PAGE分析。泳道1为LUC-ori融合蛋白酶切结果;泳道2,3为LUC-n融合蛋白酶切结果,2为5单位凝血酶,3为2.5单位凝血酶;4泳道为LUC-n融合蛋白未酶切结果,箭头所示为蝇防御素蛋白。

图3 SDS—PAGE分析。1泳道:突变LUC-n蛋白超滤离心后的离心液;2泳道:LUC-n蛋白经透析袋浓缩后的清液;3泳道:未突变LUC-ori蛋白超滤离心后的离心液;4泳道:LUC-ori蛋白透析袋浓缩后的清液。

图4抑菌实验结果。1号样品:LUC-n融合蛋白酶切液;2号样品:LUC-ori融合蛋白酶切液;3号样品:GST蛋白对照;4号样品:凝血酶对照。

图5热处理后的抑菌结果。蓝色点为LUC-n热处理结果,红点为LUC-ori热处理结果。

具体实施方式

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