[发明专利]人CYP3A5基因检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种临床上用于他克莫司药物用药指导的人CYP3A5基因检测方法及其试剂盒，特别是涉及采用实时定量荧光聚合酶链反应技术对人CYP3A5基因进行检测。

背景技术

肾移植已成为终末期肾衰竭有效临床治疗手段。肾移植手术技术已日臻完善，移植器官及移植受者的长期存活及存活质量已成为广泛关注的问题。其中重要的问题之一就是抗排斥反应制定合理的免疫抑制方案。肾移植术后免疫抑制治疗方案基本上是以钙调蛋白抑制剂为主的三联药物治疗，国内外大量临床实践证明以他克莫司为基础的联合用药可取得较为理想的抗排异效果，因此，他克莫司有非常明显的优越性，临床应用日益广泛，不仅在器官移植领域，在其它免疫系统疾病领域的应用也日益增加诸如：类风湿性关节炎，狼疮性肾炎，异位性皮炎，重症肌无力等…。近年来虽然有一些新型免疫抑制剂问世，但他克莫司仍然为主要的基础免疫抑制剂。在临床治疗中，病人对相同的药物反应不完全相同，甚至大相径庭，以前认为是个体差异所致。研究表明，这些差异主要是由于药物相关基因变异，即单核苷酸多态性(SNP)引起的。事实上，不同个体的表型差异主要在于SNP，由于SNP改变了个体对药物的代谢，因而决定某种药物是否对个体有效，是否会引起不良反应，这对于临床医生按个体化用药有重要的意义。

目前临床实践中仍采用结合临床并通过监测全血药物的谷浓度来调整本品口服的最佳用药剂量。采用这种给药方式，临床医生需要多次调整，才能找到每例患者的合适剂量，而以药物基因组学为基础的靶向治疗则不同，医生可以通过对患者的遗传学状况进行分析后，一开始就可以制订出最佳药物剂量。

他克莫司主要在肝脏代谢，细胞色素P450(CYP)是他克莫司的主要代谢酶。CYP3A亚家族是药物代谢反应中最主要的限速酶。包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。已有研究证明CYP3A4和CYP3A5是他克莫司生物转化的主要代谢酶。已经证实的CYP3A4*1B多态性影响CYP3A4酶的表达，CYP3A4*1B多态性发生在46-66％的非洲黑人，4％的高加索人，但亚洲人为0％。在CYP3A5上已经发现有几个单核苷酸多态性(SNPs)，其中一部分可以影响CYP3A5酶的表达和功能。

CYP3A5基因对他克莫司代谢的影响是通过基因表达的产物CYP3A5酶的活性来调节的，CYP3A5*3纯合子患者的总CYP3A5mRNA水平比野生型CYP3A5*1等位基因携带者显著少，CYP3A5酶表达量明显下降。研究表明，他克莫司的代谢是受CYP3A5基因调控，CYP3A5是他克莫司的代谢酶。含有CYP3A5*3等位基因的患者按常规剂量给药，则其血药浓度较CYPSA5野生型患者的血药浓度高。因此对含CYP3A5*3等位基因的患者在应用他克莫司时应较常规减少用药剂量并注意副作用的发生。而对CYP3A5*1野生型的肾移植患者应适当增加服药次数以降低排异反应。目前，一般采用直接测序或定性PCR技术检测CYP3A5基因多态性，其检测的灵敏度和特异性均不高，且耗时耗力，所以不利于预测药物疗效及指导药物的选择性用药。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种人CYP3A5基因检测试剂盒，以及采用该试剂盒特异性检测CYP3A5*1、CYP3A5*3基因多态性的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的一个目的是提供一种人CYP3A5基因检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)提供包括待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；

(2)通过扩增反应循环扩增待测样品中的靶多核苷酸；

(3)使所述荧光检测体系中的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；

(4)测定荧光发生基团所产生的荧光量，从而确定靶多核苷酸的存在及其相对量；

所述核酸扩增体系由如下组分组成：耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物和反向引物、CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性正向引物和反向引物；

所述荧光检测体系是能够与靶多核苷酸结合并且两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的两条寡核苷酸探针。

作为一种优选方案，所述：

CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性正向引物为5′-CAC TTG ATG ATT TAC CTG CCT TC-3′；

CYP3A5基因CYP3A5*1多态性的特异性反向引物为5′-GGT CCA AAC AGG GAA GAG ATA T-3′；