[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法

权利要求书

1.一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提供人类羊膜组织；

(2)用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；

(3)加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化；

(4)消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；

(5)将羊膜组织剪碎至1mm²后转移至125mL储液瓶中，加入20mL质量浓度为0.5％的I型胶原酶及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0.075～0.2％进行消化，消化在恒温摇床中进行，消化温度为37℃,转速为250～300r/min,消化至组织块融化；

(6)用PBS缓冲液稀释消化后的组织液，离心分离，取沉淀物；

(7)沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞；

(8)使用无血清培养基重悬人羊膜间充质干细胞，调整细胞密度为(3～10)×10⁵/mL置于添加了EGF的培养皿中，移入CO₂培养箱中培养48h后换液，去除杂质，每隔2～3d换一次培养基；

其中，所述无血清培养基为UltraCULTURE MEDIUM培养基；步骤(2)将羊膜组织剪碎至6×6cm²分装于50mL离心管中，步骤(3)胰酶添加量为45mL，并在恒温摇床中消化，消化时间为30min，消化温度为37℃，转速为150～300r/min；步骤(8)采用规格为10cm的培养皿，EGF添加量为100μL，浓度为1μg/mL。

2.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于：步骤(6)离心速度为1500～2000r/min，离心时间为5min。

3.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于：步骤(7)经100μm过滤筛网过滤，离心速度为1500～2000r/min，离心时间为5min。

4.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于：待原代人羊膜间充质干细胞生长至80％融合时，用0.25％的EDTA-Trypsin消化，进行传代培养。