[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法

说明书

本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，包括以下步骤：提供人类羊膜组织、用PBS缓冲液冲洗然后剪碎、加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化、加入I型胶原酶及高糖DMEM基本培养基至I型胶原酶终浓度为0.1～0.2％消化、离心分离，取沉淀物、沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞。与现有技术相比，本发明利用少量胰蛋白酶预处理羊膜组织，使羊膜组织疏松，进而利用组织特异性更好的I型胶原酶处理羊膜，大大缩短了消化的时间，简化了原代分离的步骤，而且能够获得较高的干细胞产量，获得的干细胞活力也相比现有技术大大提高。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多功能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。MSCs是多能干细胞，具有“横向分化”或“跨系分化”的能力，不仅支持造血干细胞的生长，还可以在不同诱导条件下，在体外分化为多种组织细胞。MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞。

骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是较早被认识的一种间充质干细胞，但由于抽取骨髓会给患者带来极大的痛苦，而且随着年龄的增长，细胞数量显著下降，分化能力逐渐降低，从而较难进行推广使用。目前已从脂肪、脾脏、脐血、脐带、胎肝及胎肾等组织器官中分离出间充质干细胞，但均存在一定的局限性，如取材困难、受年龄限制、涉及伦理问题、组织中间充质干细胞含量少等。所以寻求一种来源丰富，干细胞含量高，取材方便，无创性并且不受伦理学限制的MSCs来源已然成为如今的研究热点。

最近有研究发现，AMSCs具有与BMSCs相似的表型，且具有自我更新和多向分化潜能，且增殖能力比BMSCs更强。AMSCs低表达HLA-ABC，而不表达HLA-DR，从而说明AMSCs具有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，均不会发生免疫排斥反应，而且AMSCs无致瘤性，这为各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。

人羊膜来源于人胎盘组织，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚0.02～0.5mm。在电镜下，其分为5层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。羊膜属于孕妇生产后的废弃物，一个胎盘的羊膜面积大约有600cm²，而且羊膜易于从胎盘剥离，所以因羊膜具有取材方便，原料充足的特点而被认为是目前间充质干细胞的最佳来源。目前，hAMSCs原代分离培养方法可分为组织块培养法和酶消化培养法两种，组织块培养法由于不是每个组织块都能成功培养出细胞，且容易混入其他杂细胞，同时培养周期较长，不利于快速大量获取细胞，难以满足干细胞研究的需求。酶消化培养法是目前羊膜干细胞分离方法的主流，不过鉴于羊膜组织结构致密，消化酶的类型选择会对干细胞分离后的活性有着至关重要的影响。现有技术利用II型胶原酶分离的技术有着耗时长，细胞得量低以及活性下降等弱点。

发明内容

发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，该方法利用少量胰蛋白酶预处理羊膜组织，使羊膜组织疏松，进而利用组织特异性更好的I型胶原酶处理羊膜，大大缩短了消化的时间，简化了原代分离的步骤，而且能够获得较高的干细胞产量，获得的干细胞活力也相比现有技术大大提高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提供人类羊膜组织；

(2)用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；

(3)加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化；