[发明专利]一种含BAD基因的转基因红豆杉细胞及富集紫杉醇的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种促进红豆杉细胞中紫杉醇合成积累、提高培养细胞中紫杉醇产量的方法。

(二)背景技术

紫杉醇是存在于珍稀植物红豆杉树皮中一种天然抗肿瘤物质，是目前治疗乳腺癌、卵巢癌等常发性肿瘤的特效药物，因此紫杉醇的市场前景十分广阔。目前的主要问题是紫杉醇生产必须以天然珍稀植物红豆杉为原料进行分离提取，按照目前的生产技术每生产10kg紫杉醇需要消耗2.5万株红豆杉植株，红豆杉大量砍伐必然造成紫杉醇生产和红豆杉自然资源可持续发展之间的矛盾。由于受到紫杉醇高昂价格的利诱，红豆杉自然资源的掠夺性开发已使红豆杉这一珍稀林业品种面临灭绝的地步，中央电视台曾以“哭泣的红豆杉”为题进行过专门报道，引起了各级政府的高度重视，目前红豆杉已被列为国家一类保护植物。

利用红豆杉细胞培养技术生产紫杉醇具有不占用耕地、不需要大量砍伐天然红豆杉植株、不破坏自然生态环境等优点，被认为是解决紫杉醇生产和红豆杉自然资源可持续发展之间矛盾的一种新型现代生物技术，因此吸引了国内外众多研究者的关注。我国从八五开始就将红豆杉细胞培养生产紫杉醇技术的研究列为国家重点攻关项目，在经历了八五、九五连续多年的研究后，红豆杉细胞培养的一些相关技术已经相当成熟，目前已经能够进行产业化规模的大规模培养试验，然而到目前为止利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇技术仍无法真正实现产业化。制约该项技术产业化应用的核心问题之一是红豆杉细胞的紫杉醇低产问题。

围绕如何解决红豆杉细胞中紫杉醇低产问题，国内外研究者已经进行了大量的研究，包括优质细胞系的选育、培养条件的优化、培养技术的改进及紫杉醇合成关键酶基因克隆等。然而到目前为止，红豆杉培养细胞中紫杉醇低产问题仍未得到很好解决，致使利用红豆杉细胞生产紫杉醇这一高新技术在经历了十余年的研究攻关后仍然难以实现产业化应用。因此，研究红豆杉细胞中紫杉醇的高产技术是利用红豆杉细胞生产紫杉醇技术产业化的核心关键技术。

BAD基因是哺乳动物细胞凋亡基因家族中的一员。研究表明，BAD在动物体内的主要功能是促进细胞凋亡。目前尚未见到有关利用BAD基因促进红豆杉细胞中紫杉醇合成积累并提高其产量的公开报道。

为了防止BAD基因表达可能对红豆杉细胞产生的不利影响，应用EST诱导型启动子构建红豆杉诱导型BAD基因工程细胞株，通过控制诱导剂EST的添加时间和使用剂量严格控制转BAD红豆杉细胞中BAD基因的表达时期。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种促进红豆杉细胞中紫杉醇合成积累、提高培养细胞紫杉醇产量的方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种含BAD基因的转基因红豆杉细胞，所述转基因红豆杉细胞是将BAD基因重组至红豆杉细胞而获得。

进一步，所述BAD基因为小鼠BAD基因。

进一步，所述BAD基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述含BAD基因的转基因红豆杉细胞的制备方法为：将含EST启动子的pER 8.0质粒和BAD基因分别用限制性内切酶XhoI/SpeI酶切，将酶切后的产物连接，获得连接产物pEST-BAD，然后将连接产物pEST-BAD转化至农杆菌EHA105感受态细胞中，将转化后的农杆菌细胞涂布于含终浓度50mg/L壮观霉素及含终浓度50mg/L潮霉素的LB固体培养基上，37℃培养16～24h，筛选阳性菌落，即获得含BAD基因的转基因红豆杉细胞。

本发明还提供一种所述含BAD基因的转基因红豆杉细胞中紫杉醇含量富集的方法，所述的方法为：将含BAD基因的转基因红豆杉细胞接种至pH5.8±0.2、0.9～1.1mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤，优选1.0mg/L)+1.4～1.6mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸，优选1.5mg/L)+0.09～0.15mg/LGA3(赤霉素，优选0.1mg/L)+MS液体培养基中，28±2℃、转速为130～150rpm，黑暗培养25天，加入终浓度0.02mM的β-雌二醇，在28℃诱导培养10天，获得富含紫杉醇的转基因红豆杉细胞。

进一步，所述含BAD基因的转基因红豆杉细胞接种量为50～75mg/L。