[发明专利]基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法

权利要求书

1.一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法，其特征是：

A、溶液的配制

（1）碳酸氢氨溶液的配制：分别用H₂¹⁶O和H₂¹⁸O配制碳酸氢氨溶液；

（2）酶的配制：分别用H₂¹⁶O和H₂¹⁸O配制胰蛋白酶溶液；

（3）猪皮明胶溶液的配制：用H₂¹⁶O和H₂¹⁸O配制碳酸氢氨溶液溶解猪皮明胶，分别得到溶于H₂¹⁶O和H₂¹⁸O的猪皮明胶溶液；

B、同位素标记

（1） 加酶：将H₂¹⁶O配制的胰蛋白酶加入H₂¹⁶O配制的猪皮明胶中，将H₂¹⁸O配制的胰蛋白酶加入H₂¹⁸O配制的猪皮明胶中；

（2）酶解和标记：酶解和标记过程同时进行；

（3）终止反应；

C、HPLC-FTICR-MS检测

（1）标记物和未标记物的混合：以H₂¹⁸O中的猪皮明胶水解物为内标与H₂¹⁶O中的猪皮明胶水解物进行混合；

（2）上样检测：混合样品注射进入于FTICR-MS设备连接的HPLC中，对经过HPLC分离的猪皮明胶水解物进行检测，上样量为0.5-20 μg；

D、数据分析：

（1）根据氨基酸序列，寻找猪皮明胶的特征峰；

（2）分析并记录特征峰在标记前后的峰强度；

（3）定量方法的准确性分析：通过比较标记物/未标记物即¹⁸O/¹⁶O的计算值与实际混合比例检验定量方法的准确性，¹⁸O/¹⁶O按照如下公式计算：

                            

其中，I₀, I₂ 和 I₄分别代表未标记即¹⁶O的特征肽在实验中测得的单一同位素峰强度，质量高2Da的峰强度和质量高4Da的峰强度；M₀, M₂ 和 M₄分别代表未标记即¹⁶O的特征肽在理论上的单一同位素峰强度，质量高2Da的峰强度和质量高4Da的峰强度。

2.根据权利要求1所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法，其特征是：

所述配制的碳酸氢氨溶液为10-100 mM；

所述配制的胰蛋白酶溶液为0.01-1 mg/ml；

所述猪皮明胶溶液的配制是用10-100 mM的碳酸氢氨溶液溶解猪皮明胶，分别得到0.1-10 mg/ml 的猪皮明胶溶液。

3.根据权利要求1所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法，其特征是：所述同位素标记当中，H₂¹⁶O配制的胰蛋白酶和猪皮明胶的质量比为1:200-1:10， H₂¹⁸O配制的胰蛋白酶和猪皮明胶的质量比为1:200-1:10；

所述酶解和标记反应温度为15-50 ℃，反应时间为4-30 h；

所述终止反应条件为将酶解液置于70-100℃中5-30min。

4.根据权利要求1所述的一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法，其特征是：所述以H₂¹⁸O中的猪皮明胶水解物为内标与H₂¹⁶O中的猪皮明胶水解物按照质量比mg/mg为1:50-50:1混合。