[发明专利]基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪皮明胶的定量检测方法，具体涉及一种基于质谱和同位素标记建立的定量检测猪皮明胶的方法。

背景技术

明胶具有凝胶性、乳化性、起泡性、成膜性等多种功能特性，被广泛应用于食品、医药、照相等领域。目前，商业上大约95%的明胶来源于哺乳动物，如猪皮、牛皮。然而，犹太教和伊斯兰教人不吃与猪相关的食物，因此，为了鉴别食品中猪皮明胶的添加与否，数量多少，需要寻找一种能够准确定量检测食品中猪皮明胶添加量的方法。

本发明采用高效液相色谱-傅立叶变换离子回旋共振质谱（HPLC-FTICR-MS），寻找猪皮明胶酶解混合物的特征性质谱峰；通过同位素标记技术对特征峰进行标记，实现质谱峰的质荷比偏移，以同位素标记后的特征性质谱峰为内标，借助特征峰偏移前后的峰强度的不同，准确计算食品中的猪皮明胶添加量。本发明采用胰蛋白酶酶解、HPLC-FTICR-MS和同位素标记技术确定猪皮明胶添加量，国内外未有文献进行相关报道。

发明内容：

本发明旨在提供一种猪皮明胶的定量检测方法，以猪皮明胶为对象，采用胰蛋白酶酶解、同位素标记、HPLC-FTICR-MS检测，有效确定猪皮明胶的添加量。

其具体工艺方案如下：

1、溶液的配制

（1）碳酸氢氨溶液的配制：分别用H₂¹⁶O和H₂¹⁸O配制10-100 mM的碳酸氢氨溶液；

（2）酶的配制：分别用H₂¹⁶O和H₂¹⁸O配制 0.01-1 mg/ml 的胰蛋白酶溶液；

（3）猪皮明胶溶液的配制：用H₂¹⁶O和H₂¹⁸O配制的10-100 mM的碳酸氢氨溶液溶解猪皮明胶，分别得到溶于H₂¹⁶O和H₂¹⁸O的0.1-10 mg/ml 的猪皮明胶溶液。

2、同位素标记

（1）加酶：将H₂¹⁶O配制的胰蛋白酶加入H₂¹⁶O配制的猪皮明胶中，胰蛋白酶和猪皮明胶质量比mg/mg 为1:200-1:10，将H₂¹⁸O配制的胰蛋白酶加入H₂¹⁸O配制的猪皮明胶中，胰蛋白酶和猪皮明胶质量比mg/mg 为1:200-1:10；

（2）酶解和标记：酶解和标记过程同时进行，反应温度为15-50 ℃，反应时间为4-30 h；

（3）终止反应：将酶解液置于70-100 ℃中 5-30min。

3、HPLC-FTICR-MS检测

（1）标记物和未标记物的混合：以H₂¹⁸O中的猪皮明胶水解物为内标，与H₂¹⁶O中的猪皮明胶水解物按照质量比mg/mg为1:50-50:1混合；

（2）上样检测：混合样品注射进入于FTICR-MS设备连接的HPLC中，对经过HPLC分离的猪皮明胶水解物进行检测，上样量为0.5-20 μg。

4、数据分析

（1）根据氨基酸序列，寻找猪皮明胶的特征峰；

（2）分析并记录特征峰在标记前后的峰强度；

（3）定量方法的准确性分析：通过比较标记物/未标记物即¹⁸O/¹⁶O的计算值与实际混合比例检验定量方法的准确性，¹⁸O/¹⁶O按照如下公式计算：