[发明专利]一种利用外周血分离培养免疫细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫细胞的培养方法，具体涉及一种利用外周血分离培养免疫细胞的方法。

背景技术

细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。目前主要的细胞免疫治疗疗法包括细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法、树突状细胞(DC)疗法、DC-CIK细胞疗法、自然杀伤细胞(NK)疗法、DC-T细胞疗法等。

目前免疫细胞主要通过无血清培养基进行培养，但是临床上规定使用的无血清培养基需要添加一定浓度的自体血浆才能达到很好的扩增培养的效果。血浆是血液的重要组成部分，人体中自体血浆的最大含量为血液体积的55％，故尽可能的得到最大量的自体血浆是目前免疫细胞扩增培养的关键。

发明内容

现有技术的离心时间短或离心力过低导致外周血血浆分离得到的血浆量少，离心时间长或离心力过高会使得下层血细胞活率低，从而导致下层PBMC诱导培养得到的免疫细胞量少。另外，血浆少，同等自体血浆浓度的免疫细胞培养基较少，最终培养获得的细胞总量较少。本发明提供一种新的人自体血浆获得方法。离心的转速为2000rpm、时间为10min、温度4℃，在该条件下收集血浆并不影响下层血细胞的活率，并可在免疫细胞培养中获得更多的免疫细胞总量。

在常规免疫细胞培养中，除获得上层血浆外，下层细胞需经分离后获得外周血单个核细胞(PBMC)，再经诱导、扩增得到NK、NKT、CIK等免疫细胞。因此本发明通过优化血浆的收集条件，可获得更多的血浆，保证血浆的白蛋白的含量和活性因子，下层PBMC经诱导培养获得更多的免疫细胞(NK/NKT/CIK等)。

本发明通过优化离心速度、离心温度与离心时间，找到最佳的血浆收集的离心条件，获得更大的血浆量，同时也保证分离后较高的细胞活率，而且血浆蛋白及血浆中的活性因子的含量均未减少。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种利用外周血分离培养的免疫细胞的方法，包括以下步骤：

(1)将外周血在2000rpm、4℃条件下离心10min，收集上层血浆，配制成含血浆的无血清培养基，其中血浆的质量百分数为5％；

(2)将下层血细胞和生理盐水按照体积比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分离液，混合液与Ficoll分离液的体积比为1:2～2:1，离心力为700g，离心20～40min；

(3)吸取白膜层，洗涤，即得到PBMC；

(4)在PBMC中加入无血清培养基，使细胞密度为5×10⁵～20×10⁵/ml，重悬细胞沉淀，接种于无血清培养基，并添加20～300U/mL IL-2和5～50ng/mL IL-15；

(5)当细胞密度大于2×10⁶/ml时，添加无血清培养基，使细胞密度保持为5-10⁵/ml～1×10⁶/ml，补加20～300U/mL IL-2和5～50ng/mL IL-15；培养第13～15天，收集免疫细胞。

步骤(3)所述洗涤是用生理盐水洗涤两次。

步骤(3)所述白膜层在离心后的上清液从上往下数的第二层，。

本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果。

1.在现有外周血血浆分离方案中，采用常温下3000rpm的离心速度分离血浆，在获得大量血浆的同时，下层细胞有很大一部分受损，影响后续免疫细胞的培养。本发明调整了离心时间、离心转速和离心温度，不仅能较大量的获得血浆，并能保证血浆中蛋白含量的稳定和活性因子成分的不缺失；

2.在免疫细胞培养方案中，目前部分采用含胎牛血清的无血清培养基进行培养，胎牛血清培养属于动物血清，可能导致动物源性病原体的污染。所以，本发明通过优化血浆分离条件，得到足够量的高纯度的自体血浆用于培养免疫细胞，规避了使用动物血清所带来的风险。

附图说明

图1是NKT细胞100的形态图；

图2是NKT细胞的流式检测；

图3是NKT细胞的生长曲线。

具体实施方式

本发明提供的人自体血浆获得方法如下：

(1)医用抗凝管采集血样，8支，5ml/支，共40ml。