[发明专利]一种人外周血单个核细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞分离方法，具体地涉及一种人外周血单个核细胞的分离方法。

背景技术

细胞治疗是近几年兴起的疾病治疗新技术，是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。

细胞治疗以其良好的疗效，副作用小，更个体化、个性化等独特的优势，为一些难治性疾病的治疗，提供了一种选择，有时甚至是最后的选择。在当前和今后很长的历史阶段，细胞治疗都将在临床治疗中担当重要的角色，二十一世纪将是细胞治疗发挥重要作用的时代。

在免疫细胞治疗中，一般采用羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)离心沉淀法或Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。采用羟乙基淀粉离心沉淀法虽然在操作上比较简便，但是细胞分离的效果不佳，得到的细胞纯度难以满足要求，有较多的血小板、红细胞及粒细胞等。而采用Ficoll密度梯度离心法，红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的白膜层细胞，就可从外周血中分离得到单个核细胞。这个方法所得到的细胞纯度较好，但是对操作上的要求比较高，如果操作不够谨慎，分离得到的细胞在数量和纯度上都会有较大影响。

发明内容

现有技术中采用羟乙基淀粉离心沉淀法虽然在操作上比较简便，但是细胞分离的效果不佳，得到的细胞纯度难以满足要求，有较多的血小板、粒细胞及红细胞等。而Ficoll密度梯度离心法所得到的细胞纯度较好，但是对样本体积上的要求有一定的限制，如果样本体积超过50ml，分离的效果会大大降低。此外，不同的离心力与离心时间对细胞分离的效果也有较大影响，采用不同的离心参数分离出来的细胞，纯度和活力都有很大的差异。

本发明的目的是结合羟乙基淀粉沉淀以及Ficoll密度梯度离心法，对PBMC的分离方法进行改进，尤其对于大体积(>50ml)的血液样本分离更具优势。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

本发明的发明人通过研究发现：提高PBMC分离效果的关键之一是在保证分离得到的PBMC细胞的活力及数量的前提下，减少血小板、红细胞及粒细胞等杂细胞的比例，提高PBMC细胞的纯度。本发明通过不断地摸索及验证，首先使用羟乙基淀粉沉淀，在空气中自然沉降后，再采用Ficoll密度梯度离心的分离方法，得到纯度和活力都较高的PBMC。

现有技术中一般采用羟乙基淀粉沉淀法或者Ficoll密度梯度离心法。本发明结合了羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度离心法两种方法的优点，针对大容量血液样本的分离特点，先用羟乙基淀粉沉淀法去除大部分的红细胞，然后在空气中自然沉降，再用Ficoll密度梯度离心法对单个核细胞进行进一步纯化，从而得到纯度超过95％，活力超过85％的PBMC。相比没有在空气中自然沉降的方法，获得的细胞活力和纯度更高。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种人外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：

(1)将外周血离心后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀；

(2)在下层血细胞沉淀中加入等体积的羟乙基淀粉溶液，羟乙基淀粉溶液的浓度为4％-10％g/mL，混合均匀后在空气中自然沉降15～35min；

(3)将上清液缓慢转移至Ficoll淋巴细胞分离液表面，离心力为600g～800g,离心20～30min；

(4)离心后从下到上分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层和血浆层；吸取白膜层，重悬，离心；

(5)离心后弃上清液，用1640培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×10⁵～10×10⁵cells/mL,得到人外周血单个核细胞。

优选，所述羟乙基淀粉溶液的浓度为6％g/mL。

步骤(4)所述重悬是加入生理盐水。

步骤(4)和(5)所述离心的转速为1000～2000rpm/min，离心5～10min。

步骤(1)所述离心的转速为1500～3000rpm，离心时间为8～12min。

与现有技术相比，本发明具有的优点及有益效果：