[发明专利]生物催化氢化组合物及其合成罗素伐他汀手性中间体方法

权利要求书

1.一种选择性生物催化氢化组合物，其特征在于，包括葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶。

2.如权利要求1所述的选择性生物催化氢化组合物，其中底物：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)；所述辅酶为NAD⁺，NADP⁺中的一种。

3.如权利要求1或2所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0。

4.如权利要求3所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述发酵罐培养通过检测OD₆₀₀确定是否结束发酵，优选所述OD₆₀₀为0.6-0.8时，且不再增长时，结束发酵。

5.如权利要求3或4所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的二级培养后进行处理的过程均是：将二级培养液离心，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为m菌体：v缓冲液＝1：(5～10)的浓度超声/高压破碎；破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液或葡萄糖脱氢酶粗酶液；将得到的酮基还原酶粗酶液经絮凝、添加防腐剂、添加保护剂后得酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶。

6.如权利要求5所述的选择性生物催化氢化组合物，其中在所述二级培养的过程中，超声破碎时间为15-20分钟；所述的絮凝过程加入絮凝剂的量为2.5‰-3.5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入2.5g-3.5g的絮凝剂；所述防腐剂为N-羟甲基甘氨酸钠，其添加量为3‰-5‰，所述比例是质量体积比，即1000ml粗酶液中加入3g-5g的防腐剂；所述保护剂为丙三醇，其添加量为20％-40％，该比例是体积比，即100mL粗酶液加入20-40mL丙三醇。

7.如权利要求3-6任一项所述的选择性生物催化氢化组合物，其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的培养基成分为：蛋白胨10g/L-12g/L，酵母抽提物20g/L-24g/L,甘油3g/L-5g/L，磷酸二氢钾1.8g/L-2.2g/L，磷酸氢二钾14.5g/L-16.5g/L，硫酸镁0.5g/L-1g/L。

8.如权利要求2-7任一项所述的选择性生物催化氢化组合物，所述底物为(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯，得到的产物为(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸酸叔丁酯。

9.一种(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯的制备方法，其特征在于，将(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯与葡萄糖脱氢酶、酮基还原酶和辅酶混合进行反应制备得到(3R,5S)-3,5,6-三羟基己酸叔丁酯。

10.如权利要求9所述制备方法，其中所述(S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸叔丁酯：葡萄糖脱氢酶：酮基还原酶：辅酶的加入比例为1kg：(0.5kg-0.6kg)：(1kg-1.2kg)：(0.00030kg-0.00032kg)。

11.如权利要求10所述制备方法，其中所述酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶的培养方法均如下：将重组的大肠杆菌接种到斜面培养基上，之后进行一级培养、二级培养、发酵罐培养、经过后处理得到酮基还原酶或葡萄糖脱氢酶；其中所述一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为25℃-35℃，发酵液pH为6.5-7.5，优选一级培养、二级培养以及发酵罐培养的温度为30℃，发酵液pH为7.0。

12.如权利要求10所述制备方法，其中所述发酵罐培养通过检测OD₆₀₀确定是否结束发酵，优选所述OD₆₀₀为0.6-0.8时，且不再增长时，结束发酵。