[发明专利]一种褐藻胶裂解酶Alga及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明设计一种褐藻胶裂解酶基因alga。本发明还提供了含有该基因的载体和大肠杆菌重组菌株及其表达产物的生产方法和应用。

背景技术

褐藻胶是由α-L-古罗糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)两种单糖醛酸组成的线型酸性多糖，广泛地存在于海带、裙带菜等大型褐藻类植物细胞壁中。随着糖生物学与糖化学研究的逐步深入，许多海洋寡糖，尤其是褐藻胶的降解产物-褐藻胶寡糖具有多种生物学活性。例如，低聚合度的褐藻胶寡糖具有降血脂、抗病毒、抗肿瘤以及抗氧化等生物学活性，有的已经开发为药品。以褐藻胶为原料制备褐藻胶寡糖有多种方法：酸解法、氧化降解法、超声降解法和酶降解法。

其中，酸解法和氧化降解法降解条件难以控制，操作较为复杂，耗时长。超声降解法一般与其他降解法共同使用，降解产物聚合度高，不易制得寡糖；酶法降解相对于其他降解方法具有降解条件温和，反应条件易于控制，产物特异性强，得率高等优点，因此成为制备褐藻胶寡糖的首选方法。

制备褐藻胶寡糖所使用的酶即褐藻胶裂解酶，属于多糖裂解酶家族成员，能够催化糖醛酸单元之间的1，4糖苷键发生水解，在断裂后新形成的非还原端生成双键。按照其底物特异性的差异，褐藻胶裂解酶可以分为三类：专一性降解聚甘露糖醛酸的聚甘露糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.3)、专一性降解聚古罗糖醛酸的聚古罗糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11)和能降解上述两种片段的双功能褐藻胶裂解酶。由于其具有底物专一性，褐藻胶裂解酶主要用于制备特异性结构的褐藻胶寡糖，研究褐藻胶的化学结构等方面；此外，褐藻胶裂解酶还可以应用于治疗肺囊肿性纤维化，制备海带等大型褐藻的原生质体等。

褐藻胶裂解酶主要来源于海洋动植物(包括海洋软体动物、海洋藻类)和多种微生物(包括海洋细菌、土壤细菌和真菌)。根据其底物特异性不同，可分为两大类：专一性降解聚甘露糖醛酸的裂解酶(EC4.2.2.3)和专一性降解聚古罗糖醛酸的裂解酶(EC4.2.2.11)；此外还有一些能够降解上述两种片段的双功能裂解酶，主要是来源于交替假单胞菌NO272(Pseudoalteromonassp.NO272)的褐藻胶裂解酶Aly；从交替假单胞菌Pseudoaltermonassp.SM0524中分离得到的AlySJ-02；从Isoptericolahalotolerans分离得到褐藻胶裂解酶以及从麦芽寡养单胞菌(StenotrophomsamaltophiliaKJ-2)克隆得到的褐藻胶裂解酶；以上四种裂解酶均具有降解PM和PG的能力，降解产物多为DP2-6的寡糖。双功能的褐藻胶裂解酶由于其广泛的底物特异性而在工业生产上具有重要的应用价值，主要用于褐藻胶寡糖的生产。本发明所涉及的褐藻胶裂解酶具有降解两种片段的能力，同时对于不同底物的产物聚合度比较单一，均以三糖为主要产物，具有重要的工业应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型褐藻胶裂解酶Alga及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型褐藻胶裂解酶Alga的方法。

本发明的第三个目的是提供新型褐藻胶裂解酶Alga基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供新型褐藻胶裂解酶Alga在褐藻胶降解中的应用。

本发明所提供的褐藻胶裂解酶Alga，来源于弧菌菌株Vibrioalginolyticus40B，其氨基酸序列具有如下特征之一：

1)序列表中的SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-521或者18-521位氨基酸残基序列，其中1-17位为信号肽序列，18-521位为有活性的褐藻胶裂解酶Alga的氨基酸。

2)将序列表中的SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-521位或18-521位氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后具有降解褐藻胶活性的蛋白质。

本发明提供了新型褐藻胶裂解酶Alga的编码基因(命名为alga)，具有下述核苷酸序列特征之一：

1)序列表中SEQIDNO.1的脱氧糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQIDNO.1氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

本发明的新型褐藻胶裂解酶Alga的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的Alga的氨基酸序列及其核苷酸序列人工合成获得。

制备重组酶Alga的方法，是将编码基因alga克隆到重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的褐藻胶裂解酶。