[发明专利]源于大鼠及其它动物的多潜能细胞在审
申请号: | 201410720584.X | 申请日: | 2007-08-01 |
公开(公告)号: | CN104531610A | 公开(公告)日: | 2015-04-22 |
发明(设计)人: | 应其龙;A·G·史密斯 | 申请(专利权)人: | 爱丁堡大学管理处 |
主分类号: | C12N5/0735 | 分类号: | C12N5/0735 |
代理公司: | 广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 | 代理人: | 江侧燕 |
地址: | 英国*** | 国省代码: | 英国;GB |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 源于 大鼠 其它 动物 潜能 细胞 | ||
技术领域
本发明涉及维持多潜能细胞的自我更新能力。本发明提供的方法和组合物适于培养及分离多潜能细胞如胚胎干细胞(ES),尤其是哺乳动物的胚胎干细胞,哺乳动物的包括大鼠、小鼠、牛、绵羊、猪以及人。本发明尤其涉及大鼠、小鼠和人的多潜能细胞的自我更新培养以及与之相关的方法及组合物。
背景技术
目前已广为人知的是:在体外起始及维持多潜能干细胞均是在含有血清和白血病抑制因子(LIF)的培养基中进行的(Smith et al.(1988)Nature 336:688-90)。这类方法已被用来维持源于“许可的”(permissive)小鼠的多潜能胚胎干细胞(ES)传代(passage)很多次。维持多潜能干细胞的自我更新还可以通过其它方式来完成,如将干细胞培养在含有饲养细胞或其提取物的培养基中,通常用小鼠成纤维细胞作为饲养细胞。这些条件使得在培养基中多次传代人类胚胎干细胞的同时维持其多潜能性状成为可能。
许多情况下,ES细胞仅能在含有以下成分的培养基中被维持或最好地维持,如含有血清或血清提取物的培养基(因此这些培养基的成分是不明确的);或者含有其它细胞的培养基,如利用成纤维细胞作为饲养细胞的培养基。但是,任何不明确的成分,不管是本已存在于培养基中的还是例如由饲养细胞产生的,均可能干扰或阻碍对ES细胞繁殖和分化的研究。这阻碍了ES细胞及其子细胞在治疗学或其它应用方面的生产实践发展。目前已有一些成分明确的ES细胞培养基,然而仍需要可供选择的、最好是改良的成分明确的ES细胞培养基。
在本发明的申请人之前的公开号为WO 03/095628的国际申请,及之后还未公开的一申请中,以下的无血清培养基被用来培养多潜能干细胞如ES细胞并促使其进行多代自我更新,所用的无血清培养基中含有(1)gp130激活剂(如LIF)和(2)TGF-β家族或Id信号传导途径的激活剂(如BMP4)。意外地发现,在gp130信号传导途径畅通的情况下,TGF-β家族或Id信号传导途径的激活剂可刺激多潜能干细胞自我更新而非向其传递分化前信号。然而,还需要提高维持多潜能细胞自我复制性状的效率,以及改良一些培养基,这些培养基用于将多潜能细胞从饲养细胞或含有饲养成分的培养基中转移。
Sato N等(Nat.Med.2004,Jan 10(1)pp55-63)描述了糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂、6-溴靛玉红-3-肟(6-bromoindirubin-3’-oxime)对培养在含血清培养基中的小鼠和人ES细胞的影响。然而,仅在很短的时间段内观察了这些影响,这些观察是如此短暂以致不能得出稳定的结论,并且研究中所用的成分不明确培养基中的未知因子的影响也可能较显著。本发明的发明人曾经尝试过那个实验,但是不能重复获取所述实验结果,实际上观察到了与所述结果相反的影响。
在配制ES细胞培养基时,人们希望能得到尽可能纯的单独培养基成分。然而,大部分培养基成分是细胞因子,由于需要在细胞中生产它们继而去除所得产物中潜在的污染物,这些细胞因子的纯度难以保证。一些细胞因子的另一个问题是:它们仅在很窄的浓度范围内是有效且无毒的。有较宽浓度范围和/或在较高浓度下具有较小毒性的培养基成分会很有用。细胞因子的储存稳定性有限,人们也在寻找更稳定的培养基成分。
本发明的一个目的是克服或至少改善现有技术中存在的问题,希望提供可供选择的最好是改善的培养多潜能干细胞的方法和培养基,这些培养基和培养方法能够支持所述干细胞进行多代自我更新。本发明的另一个目的是提供一种可供选择的培养体系以能够在体外培养多潜能干细胞并维持其性状直至以可控方式诱导这些干细胞的分化。本发明的一个更进一步的目的是为改善多潜能干细胞的获得和分离提供方法和组合物,方便从难处理器官及尚未分离出多潜能干细胞的器官中获取并分离出多潜能干细胞。本发明一个更进一步的目的是从这些器官中得到多潜能干细胞。
发明内容
根据本发明的一方面,通过抑制多潜能细胞中的GSK3、MEK和一FGF受体可以促进多潜能细胞的自我更新。
根据本发明,多潜能干细胞如ES细胞,被培养在含有一种MEK抑制因子、一种GSK3抑制因子和一种FGF受体拮抗剂(例如一种小分子GSK3抑制因子、一种小分子MEK抑制因子和一种小分子FGFR拮抗剂)的培养基中,优选使用无血清培养基,从而促进干细胞进行多代的自我更新。因此,抑制多潜能细胞中的GSK3、MEK和FGF受体传导途径刺激了这些细胞的自我更新。
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