[发明专利]一种高产间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

间苯三酚是一种重要的精细化工产品，是合成黄酮、异黄酮类药物的中间体，间苯三酚本身可作为一种优良的平滑肌解痉药物，广泛应用于临床。间苯三酚还能抑制过氧化物酶活性，具有抗炎抗氧化作用，它可催化H₂O₂分解为分子氧和水，是一种重要的抗氧化酶。此外，间苯三酚还是一种性能优越的抗养护剂、稳定剂、燃料偶合剂、轮胎增粘剂等，具有广阔的市场需求。目前，间苯三酚的工业化生产方法主要为化学合成法，包括三硝基甲苯(TNT)法、异丙基苯法、氯代苯法和苯胺法。化学合成法存在多种弊端，如原料来源困难、副产物较多、分离提纯困难、环境污染严重等。以微生物发酵生产间苯三酚，可以克服化学法的多种弊端，并且生物法合成间苯三酚周期短，安全环保。

异源表达荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phlD可以合成间苯三酚(Jihane Achkar,Mo Xian,Huimin Zhao,J.W.Frost.Biosynthesis of phloroglucinol[J].Journal of the American Chemical Society,2005,127(15):5332-5333.；Wenjuan Zha,Sheryl B.Rubin-Pitel,Huimin Zhao.Characterization of the substrate specificity of PhlD,a type III polyketide synthase from Pseudomonas fluorescens[J].Journal of Biological Chemistry,2006,281(42):32036-32047.)。在此基础上表达多重抗性激活因子marA，增强大肠杆菌对间苯三酚的耐受性，表达大肠杆菌自身的乙酰CoA羧化酶基因(ACCase)，细胞内丙二酸单酰CoA的水平为原始菌株的3.6倍(Yujin Cao,Xinglin Jiang,Rubing Zhang,Mo Xian.Improved phloroglucinol production by metabolically engineered Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011,91:1545–1552.)。然而，间苯三酚目前的产量、产率仍然偏低，难以满足工业生产的需求。需要进一步对工程菌株进行基因改造，以期提高间苯三酚的合成能力。

大肠杆菌的代谢网络包含数百种代谢物，这些代谢物通过大量的生化和调节反应相互关联。代谢流的调控可在基因表达水平，转录后水平，酶活动力学等不同水平通过多种复杂机制实现。转录后水平的调控是大肠杆菌的一种重要的调节模式。全局调控因子本身包含复杂的代谢网络，发挥作用时呈现多效性，能够同时调节多种功能不同的操纵子，因此，全局调控因子对于某些特定代谢物的影响较为复杂。Csr是一种碳存储调节因子(carbon storage regulator)，在转录后水平全局性调控多个操纵子表达。Csr系统含有多种组分，CsrA作为转录后调节子能够与靶标mRNA结合，抑制翻译的正常进行，CsrB是一种非编码RNA分子，含有CsrA的多个结合位点，拮抗CsrA的作用(M Y Liu,T Romeo.The global regulator CsrA of Escherichia coli is a specific mRNA-binding protein[J].J.Bacteriol,1997,179(14):4639-4642.)。外源导入重组质粒诱导CsrB过表达，可以提高碳源利用率，乙酸产量从5g/L降低至2g/L(Adrienne E McKee1,Becky J Rutherford，et.ac.Manipulation of the carbon storage regulator system for metabolite remodeling and biofuel production in Escherichia coli[J].Microbial Cell Factories 2012,11:79)。

过表达phlD、ACCase等基因可提高间苯三酚产量，但目前间苯三酚的产量和产率仍无法满足工业生产的需求。CsrB是大肠杆菌内重要的全局性调控因子，该调节因子对间苯三酚发酵生产的影响暂无报道，通过全局性调控碳代谢提高间苯三酚合成能力的基因改造方法也无报道。

发明内容