[发明专利]基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法

权利要求书

1.一种基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：利用高分子材料和人新生皮肤成纤维细胞柱交替打印出血管形状，经过融合后，去除上述高分子材料，构造出组织工程血管；向血管中灌注晚期内皮祖细胞，在生物反应器内经过7天的体外动态培养，获得分化的组织工程血管，所述高分子材料为普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺、甲基纤维素或阮藻酸钠的一种。

2.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：具体步骤如下：

步骤a、细胞处理：

(a1)从培养箱中取出装有人新生皮肤成纤维细胞的培养皿，用磷酸盐缓冲液清洗后，用胰蛋白酶消化细胞；

(a2)处理后的细胞重悬于细胞培养液，置于组织培养瓶中；

(a3)培养瓶在旋转振动器上培养，使受损细胞恢复附着能力，离心把细胞分离出来；

(a4)利用3D打印机将细胞柱挤出在特制的、无粘着力的聚四氟乙烯或琼脂糖基上，过夜培养，使细胞柱成熟；

步骤b、高分子材料处理：

选择液态的上述高分子材料，当高分子材料吸入打印头上的微量吸液管时，浸入磷酸盐缓冲液中，使得材料固化，可获得连续挤出的条状高分子材料；

步骤c、3D血管打印：

3D打印机含有两个打印头，一个挤出条状高分子材料，另一个挤出人新生皮肤成纤维细胞柱，打印前编写打印程序，输入电脑；

(c1)装载：将附有微量吸液管的打印头A伸入装有液体高分子材料的小瓶中，将高分子材料吸入吸液管中；

(c2)挤出：将交联后的高分子材料挤出在一个培养皿中；

(c3)当需要细胞打印时，将成熟的细胞柱吸入微量吸液管，装在打印头B上，打印方法同高分子材料；

(c4)打印完成后，经过2-4天的融合过程，去除高分子材料，获得血管结构；步骤d、内皮细胞灌注：

(d1)利用动脉鞘插入，从患有脉管疾病的病患中获取50mL的外周血，借助流式细胞仪，从外周血中提取分离晚期内皮祖细胞；

(d2)将分离出的晚期内皮祖细胞注入之前获得的血管内腔，旋转；

(d3)对步骤(d2)得到的血管在生物反应器进行为期7天的体外培养。

3.如权利要求2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(a3)中，培养瓶在旋转振动器上在体积浓度为5％的CO₂环境、37℃下培养1h，转速3500rpm下离心分离。

4.如权利要求2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：所述高分子材料为普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺或甲基纤维素时，在步骤(c1)装载的步骤后还有交联的步骤：将装载有液体高分子材料的吸液管浸入装有磷酸盐缓冲液的小瓶中，使高分子材料快速交联。

5.如权利要求1或2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(c5)中，采用改变温度的方式去除普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺或甲基纤维素。

6.如权利要求1或2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(c5)中，采用螯合的方式去除阮藻酸钠。

7.如权利要求6所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：采用离子螯合的方式去除阮藻酸钠的步骤为：将质量浓度为2％wt明胶煮沸，加入NaCl使其质量浓度为0.9％wt、加入CaCl₂使其摩尔质量浓度为10mmol/L，煮沸2分钟后，放置冰箱中8h后，将上述混合物事先涂覆在装载打印物的培养皿上；在阮藻酸钠中掺入乙二胺四乙酸，挤出在铺有上述混合物的培养皿上；乙二胺四乙酸和Ca²⁺发生螯合作用，阮藻酸钠降解。

8.如权利要求2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(d2)中，细胞浓度为5x10⁵个/mL。

9.如权利要求2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(d2)中，旋转的条件是：温度37℃，转速10rph，旋转30min。

10.如权利要求2所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，其特征在于：步骤(d3)中，体外培养的条件是：施以6.8dynes/cm²的壁面剪切应力，37℃恒温。