[发明专利]基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术，特别明涉及用于治疗脉管疾病的组织工程血管，即采用3D打印的方式，制备出去支架化的组织工程血管，应用于修复或替换受损或病变的原生血管。

背景技术

血管替换是治疗脉管疾病的有效方法之一。常用的替换血管分为自体血管、异体血管和组织工程血管。人类自体血管来源有限，异体血管又存在免疫排斥，从而组织工程血管构建的研究变得尤为重要。

组织工程血管构建的基本途径是，采用与血管相似的天然或人工合成材料构建支架，在支架上种植种子细胞并培养，最终形成结构、功能与自体血管相似的组织。

目前常使用的组织工程血管有涤纶人造血管，聚氨酯材料人造血管、真丝人造血管等高分子材料人工血管。由于这一系列高分子材料人造血管都存在着生物兼容性差、使用年限短、远期通畅率差，容易造成疾病复发等问题。近年来，随着组织工程的发展，人们开始通过3D生物打印技术探索制造新型人工血管，3D生物打印技术是以高分子生物材料、细胞、细胞外基质等成分作为打印墨汁而进行活体打印的新技术。其优势就在于精确可控的三维打印细胞及生物材料的使用，并且可根据病人病变血管的形状及大小个性化的定制打印人工血管。

目前3D生物打印技术在打印血管时所采用的方式是在培养器皿中层层堆积生物墨汁细胞，然后通过后续的生物培养得到所需要的人工血管。其血管成型的具体方法有两种：第一种是垂直堆积，第二种是平行堆积成型，这两种方法同样受到血管杆的机械性能影响，获得的人工血管细胞分布杂乱，不容易精确控制。同时，这两种血管打印成型方法都存在成型速度慢、效率低，打印出的成品结构不理想，无法形成完整的生物血管等问题。

目前的组织工程血管是以水凝胶为支架材料为支架，在培养器皿中层层堆积生物墨汁细胞，然后通过后续的生物培养得到所需要的人工血管。这种方式存在以下缺点：水凝胶为支架材料存在机械强度不足，细胞密度低，替换血管的细胞相容性和组织相容性低。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，以克服以水凝胶为支架材料的机械强度不足，从而使得到的组织工程血管获得较高的细胞密度，同时提高了替换血管的细胞相容性和组织相容性。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法，利用高分子材料和人新生皮肤成纤维细胞柱交替打印出血管形状，经过融合后，去除上述高分子材料，构造出组织工程血管；向血管中灌注晚期内皮祖细胞，在生物反应器内经过7天的体外动态培养，获得分化的组织工程血管，所述高分子材料为普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺、甲基纤维素或阮藻酸钠的一种。

具体步骤如下：

步骤a、细胞处理：

(a1)从培养箱中取出装有人新生皮肤成纤维细胞的培养皿，用磷酸盐缓冲液清洗后，用胰蛋白酶消化细胞；

(a2)处理后的细胞重悬于细胞培养液，置于组织培养瓶中；

(a3)培养瓶在旋转振动器上培养，使受损细胞恢复附着能力，离心把细胞分离出来；

(a4)利用3D打印机将细胞柱挤出在特制的、无粘着力的聚四氟乙烯或琼脂糖基上，过夜培养，使细胞柱成熟；

步骤b、高分子材料处理：

选择液态的上述高分子材料，当高分子材料吸入打印头上的微量吸液管时，浸入磷酸盐缓冲液中，使得材料固化，可获得连续挤出的条状高分子材料；

步骤c、3D血管打印：

3D打印机含有两个打印头，一个挤出条状高分子材料，另一个挤出人新生皮肤成纤维细胞柱，打印前编写打印程序，输入电脑；

(c1)装载：将附有微量吸液管的打印头A伸入装有液体高分子材料的小瓶中，将高分子材料吸入吸液管中；

(c2)挤出：将交联后的高分子材料挤出在一个培养皿中；

(c3)当需要细胞打印时，将成熟的细胞柱吸入微量吸液管，装在打印头B上，打印方法同高分子材料；

(c4)打印完成后，经过2-4天的融合过程，去除高分子材料，获得血管结构；步骤d、内皮细胞灌注：

(d1)利用动脉鞘插入，从患有脉管疾病的病患中获取50mL的外周血，借助流式细胞仪，从外周血中提取分离晚期内皮祖细胞；

(d2)将分离出的晚期内皮祖细胞注入之前获得的血管内腔，旋转；

(d3)对步骤(d2)得到的血管在生物反应器进行为期7天的体外培养。