[发明专利]痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物酶法制备共轭亚油酸的技术领域，涉及利用脂肪酶和亚油酸异构酶联合催化制备共轭亚油酸的方法及反应体系。

背景技术

共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid, CLA）是由必需脂肪酸亚油酸（Linoleic Acid, LA）衍生的一系列含有共轭双键的十八碳二烯酸（octadecadienoic acid）的异构体的总称。其中，cis-9,trans-11 CLA和trans-10, cis-12 CLA被认为是主要的生物活性单体，具有多种生理活性，如抗癌症、抗动脉粥样硬化、降血脂、减肥、促进生长等，在医药、食品、保健品和化妆品等行业中具有广阔的应用前景。

天然 CLA主要存在于反刍动物的肉和乳中，相对于专家建议每日需要的CLA食入量，以食用动物的肉和乳作为CLA的摄取方式是远远不够的，因此对CLA合成转化的研究越来越得到广泛的关注。化学合成方法制得的产物往往包含一些活性功能尚不明确的异构体，而亚油酸异构酶（Conjugated linoleic acid isomerase）可特异性地催化亚油酸 (LA) 转化为活性CLA异构体，并且反应条件温和，目前已得到众多国内外研究者的关注。来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶（Propionibacterium acnes isomerase，PAI）是为数不多的可以将亚油酸转化生成t10, c12 CLA的几种亚油酸异构酶之一，并且其蛋白晶体结构已经得到解析。对其的酶学性质研究发现其最适反应条件温和且具有较好的反应活性，适合工业化应用。故本研究选用PAI作为联合催化反应体系中的关键酶之一。

然而，游离亚油酸在自然界中很少存在，大多数是通过化学合成所得，因此价格较贵而且不利于扩大转化生产。大豆油中的亚油酸含量很丰富，是亚油酸的经济来源之一，其总脂肪酸中约54%是亚油酸(主要以甘油三酸酯的形式存在)。根据对亚油酸异构酶的底物特异性及蛋白晶体结构分析发现其只能利用游离的亚油酸来异构化产生CLA，而不能利用亚油酸的甘油三酯形式，但这种形式的亚油酸是豆油中亚油酸的主要存在形式。

脂肪酶属于水解酶类（hydrolase），能水解大豆油中的甘油三酯成分释放出游离的脂肪酸，其中亚油酸成分可以作为亚油酸异构酶的特异性底物来催化生成共轭亚油酸。米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase，ROL）是作为一种典型的脂肪酶，目前已得到了广泛的研究，对其的催化水解甘油三酯的能力也得到了众多研究学者的肯定，并且ROL的反应条件温和，对碳链长度为C8-C18的脂肪酸表现出偏爱性，故本实验采用ROL作为联合催化反应体系的另一种关键酶。

大豆油对亚油酸异构酶转化生成CLA来说不是一种合适的底物，但在脂肪酶的协助下，大豆油中以甘油三酯形式存在的亚油酸对亚油酸异构酶来说变得可利用，这为联合催化反应体系的建立提供了理论基础。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供亚油酸异构酶PAI的一种表达载体及重组菌；本发明的另一目的是提供一种制备共轭亚油酸的联合催化方法包括其催化工艺条件和ROL和PAI两种酶的最适添加量，使其能够经济高效地从天然植物油料大豆油直接催化制备共轭亚油酸。

技术方案：痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

编码上述痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的基因，该基因的核苷酸序列paiI如SEQ ID NO.2所述。

包含所述核苷酸序列的重组质粒pET20b-paiI。

包含所述核苷酸序列的重组质粒pET20b-paiI的制备方法，其特征在于构建步骤为：将经序列优化获得的基因paiI和pET20b用内切酶Nde I和xho I酶切，连接构建重组质粒pET20b-paiI，获得重组质粒pET20b-paiI。

含有所述重组质粒pET20b-paiI的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。