[发明专利]一种采用逆流色谱技术一步纯化大蒜多糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纯化大蒜多糖的方法，特别是一种采用逆流色谱技术一步纯化得到高纯度的大蒜多糖的方法。 

背景技术

大蒜多糖是大蒜中含量最高的保健功能成分，占鲜蒜的15％～25％，具有增殖肠道益生菌，协助消化、增强免疫力、防止肝损伤、抗氧化和抗病毒等多种功效。大蒜多糖在医药、食品等领域具有较广泛的实际应用前景。

目前，大蒜多糖的提取方法主要有热水、稀盐、稀碱和稀酸提取，也有用复合酶处理、超声辅助加速多糖释放的提取方法。热水浸提法是一种常用的提取植物多糖的方法，其优点是成本低廉、工艺简单、无需特殊仪器设备，可用于大规模生产，其缺点是提取工艺时间长。酶法提取是采用酶与热水浸提相结合的方法，有复合酶法和单一酶法。常用的酶有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等。酶法提取植物多糖具有反应条件温和、提取率高、杂质易除、提取时间短，工艺简便，而且能保持多糖的天然活性，但有些酶的价格较高，使用的条件比较苛刻。酸碱提取法是利用在稀酸或稀碱作用下，植物或菌类的细胞、细胞壁被充分溶胀以致破裂，使其中游离的多糖增加，更易溶解在稀酸或碱水溶液中，利用这一特性可提高此类多糖的提取率。但是，稀酸、稀碱在浓度因子难以控制的情况下易使多糖发生糖苷键的断裂，使部分多糖发生水解而降低提取率。因此，开发高效的大蒜多糖分离提取法是非常必要的。

高速逆流色谱技术（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）是一种连续高效的无固相载体的液-液分配色谱技术，最初由美国国立健康研究院 Ito 教授研制开发。由于不需要固相载体，物质的分离依据其在互不相溶的两相液体中的分配系数的差异而实现，因而避免了物质在固定相不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等问题，分离到的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然产物中有效成分的分离。高速逆流色谱因其不使用固体固定相，不存在不可逆吸附现象，并且有广泛的溶剂体系可供选择。从理论上讲HSCCC可以适用于任何极性范围样品的分离，甚至可以分离多糖和蛋白之类物质，因此应用范围很广，具有很好的适应性，在分离天然化合物方面有其独到之处。 

发明内容

为了克服目前大蒜多糖提取的工艺时间长、价格较高、条件比较苛刻及提取效率较低的问题，本发明提供一种采用逆流色谱技术一步纯化大蒜多糖的方法；该方法采用逆流色谱技术纯化大蒜多糖不仅能够实现纯度高、操作简单、效率高、价格低，而且还优化了制备高纯度大蒜多糖的提取工艺，为规模分离纯化大蒜多糖精品提供技术支持，有很好的推广应用价值。

本发明的技术方案包括如下步骤：

A. 洗涤去杂：将新鲜大蒜去皮，洗去杂质。

B. 破碎浸提浓缩：将洗净的大蒜破碎，用75%乙醇水溶液超声循环提取两次，两次提取液合并浓缩。

C. 大蒜多糖粗提液经大孔树脂处理：将浓缩液复溶上DA201极性大孔树脂柱，上样量为柱体积的10%，用水作淋洗液，浓缩流出液。

D. 经逆流色谱一步纯化大蒜多糖：逆流色谱溶剂系统为MgSO₄:PEG:H₂O，硫酸镁的百分含量为14～18%，PEG（聚乙二醇）分子量为1000～1500，含量为12%～15%。配置好的溶剂放入分液漏斗中，静止过夜，取上相作为固定相，下相作为流动相。逆流色谱仪柱温为25℃，转速为800-1000r/min，转向为正向。用上下相1：1的溶液对浓缩液进行稀释，使多糖含量为1～2mg/mL。上样体积为柱体积的1/10～1/20。定时或定量进行收集，对收集到的各管采用硫酸—苯酚法进行多糖测定。

E. 透析及干燥：将适量体积的上述溶液装入截留分子量为3000的透析袋中，对水透析过夜，将透析过的溶液进行冷冻干燥，得大蒜多糖精品。

以本发明所述方法制备的大蒜多糖分子量为 5400 ，纯度为97%以上。纯度和分子量的测定方法为凝胶柱层析法，所用柱填料为葡聚糖凝胶G-100，分离范围：3000-120000，柱高为35cm，检测器为蒸发光检测器，漂移管温度：80℃，气流量：4.5L/min，葡聚糖分子量标准：4320、12600、60600、110000。多糖含量测定方法为硫酸----苯酚法。

纯化大蒜多糖采用的是逆流色谱法。

逆流色谱法所用的溶剂系统为MgSO₄:PEG:H₂O，其中，硫酸镁的百分含量为14～18%，PEG（聚乙二醇）分子量为1000～1500，含量为12%～15%。