[发明专利]氢离子转运无机焦磷酸酶基因表达差异在番茄耐盐性上的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及氢离子转运无机焦磷酸酶（H⁺-PPase）基

因表达差异在番茄耐盐性上的应用。更具体地说是一种利用H⁺-PPase基因表达差异检测番茄耐盐性的检测方法。

背景技术

随着人类社会的发展，人们对土地不断开发利用，致使土壤次生盐渍化程度日益加重。作为主要的蔬菜作物之一，番茄的耐盐性研究引起人们高度重视，相关研究已逐渐展开和深化。但因涉及到的参数和指标包括形态、生物量和生理生化等多个方面，加上鉴定时期也各不相同，故目前尚未形成统一的方法和标准用于番茄耐盐性鉴定。番茄耐盐性鉴定方面的研究主要两种，一种是形态鉴定，地上部鲜重、根鲜重、地上部干重、根干重、壮苗指数、根／冠比作为幼苗期耐盐鉴定指标；其次是生理生化指标，主要有脯氨酸、可溶性糖、丙二醛、相对叶绿素含量(SPAD)、SOD活性、POD活性等。番茄耐盐性的遗传规律还不是很清楚,控制耐盐基因的遗传定位也有待于深入研究，特别是还没有找到能对番茄耐盐性进行可靠、高效的鉴定方法。半定量RT-PCR 技术是研究植物的基因表达水平变化的一项重要技术，根据PCR 扩增产物的量可以确定目标基因的表达水平。RT-PCR为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。反转录PCR是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。 

H⁺-PPase是定位于植物液泡膜上的一种H⁺转运蛋白，它水解ppi为pi的同时能将H⁺从细胞质跨过液泡膜泵入植物液泡中，从而起到酸化液泡、维持跨液泡膜H⁺梯度的作用。近几年，此酶在植物抵御盐胁迫和调节植物生长方面的功能中逐步被认识，并广泛应用。

本研究以番茄为材料，通过Real-time PCR技术对番茄盐胁迫时H⁺-PPase基因的表达差异性分析，鉴定番茄耐盐性。其目在于针对目前还没有找到能对番茄耐盐性进行可靠、高效的鉴定方法，从基因水平上区分耐盐性不同的番茄基因型，为培育抗逆性提高的番茄及其他植物新品种提供行之有效的检测方法。

发明内容

本发明目的是利用盐胁迫时离体叶片中H⁺-PPase（氢离子转运无机焦磷酸酶）基因的表达差异来检测番茄的耐盐性。

为实现上述目的，本发明通过以下方法予以实现：

一种用于番茄耐盐性测定的特异性引物，它具有SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列：

H⁺-PPase  Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct gct

Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca。

本发明进一步公开了采用特异性引物进行番茄耐盐性测定的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

    （1）以5-6叶番茄苗为材料，取番茄植株第一片成熟叶，离体叶片用蒸馏水冲洗3次，去离子水冲洗1次，叶片用剪刀剪成1×2cm大小的长方形，然后用去离子水冲洗3次，吸水纸吸干水分；

（2）选择化学纯的NaCl，5-8%（w/w），处理时间为2-6min,提取叶片总RNA；优选NaCl，5%（w/w），处理时间为2min。

(3)将得到的cDNA溶液用于下一步PCR扩增；

（4） Real-time PCR 

 引物设计：

H⁺-PPase  Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct gct

Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca

    Real-time PCR反应体系：

模板：3ul

引物（0.4nM）：2ul

All-in-one：10ul

MOX：0.4ul

水：2.6ul

其中所述的取番茄植株第一片成熟叶指的是从上往下数的第一片成熟叶。