[发明专利]基于代谢组学改进刺糖多孢菌发酵条件以提高多杀菌素产量的方法

权利要求书

1.基于代谢组学改进刺糖多孢菌发酵条件以提高多杀菌素产量的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)对刺糖多孢菌胞内的代谢物进行测定：

①细胞收集及淬灭：

在培养基1中对刺糖多孢菌进行发酵培养，在刺糖多孢菌发酵的对数期和稳定期,每个时期至少一个时间点取样5-10ml，每个时间点取样3-5份，将所取样品与18-20mL淬灭液混合均匀后放置5-10min，在3000-5000rpm，4℃，离心3-5min，弃上清液；用4℃蒸馏水洗涤除去细胞上的培养基成分；3000-5000rpm，4℃，离心3-5min，弃上清液，保留菌体；反复洗涤2-4次；所述淬灭液是体积浓度为60％的甲醇水溶液；所述培养基1为：葡萄糖72g/L、玉米浆12g/L、谷氨酸钠2.4g/L、豆粉18g/L，余量为水，调pH＝7.5，灭菌；

②提取细胞内代谢物：

取步骤①获得的细胞在研钵里加液氮研磨，称取40-50mg用液氮研磨好的细胞置于1.5mL离心管中，加入0.5-1mL温度为-30℃的提取液，涡旋混匀器充分混匀后液氮冻融2-4次得到冻融液；将冻融液在4℃，3000-5000rpm、离心3-5min，取上清液称上清液a至另一离心管中；下层细胞再加入0.5-1mL，温度为-30℃的提取液，涡旋混匀器充分混匀后，4℃，8000-10000rpm、离心3-5min，取上清液称上清液b，将上清液a和b混合均匀得上清液c，8000-10000rpm，4℃，离心3-5min，取260μL上清液c转至1.5mL离心管，加入50uL浓度为0.3mg·mL^-1琥珀酸-2,2,3,3-d₄水溶液，涡旋混匀器充分混匀后，-40℃条件下，真空冷冻干燥得样品，于超低温冰箱中保存；所述提取液为体积浓度为50％甲醇水溶液；

③代谢物衍生化

向步骤②获得的样品中加入50μL浓度为20mg·mL^-1的甲氧基铵盐酸盐的吡啶溶液，于40℃水浴中反应70-100min，加入80μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴反应20-60min，放入已编号的GC进样瓶中，室温静置2h；

④GC-MS检测

采用GC-MS对步骤③所得样品进行定性和定量处理，条件如下：

色谱柱：硅色谱柱，HP-5MS，30m×0.25mm，0.25μm；

进样量：1μL；；

分流比为1:10；

载气：高纯氦气，纯度：99.9995％；

进样口温度：280℃；

GC–MS接口温度：280℃；

氦气流速：恒压，91KPa；

升温程序：70℃保持2min，以5℃·min^-1的速度升到290℃，并在290℃保持3min，再降温到30℃；

电离方式：电子轰击电离；

离子电流：40μA；

电离电压：70eV；

源温：250℃；

扫描范围：50-800m/z；

扫描速度：2scan·s^-1；

从而获得了刺糖多孢菌的代谢物定性和定量数据；

(2)对刺糖多孢菌产多杀菌素能力进行分析：

①细胞收集及淬灭：

在培养基2中对刺糖多孢菌进行发酵培养，分别在刺糖多孢菌发酵的对数期和稳定期的每个期的至少一个时间点取样5-10ml，每个时间点取样3-5份，将所取样品与18-20mL淬灭液混合均匀后放置5-10min，在3000-5000rpm，4℃，离心3-5min，弃上清液；用4℃蒸馏水洗涤除去细胞上的培养基成分；3000-5000rpm，4℃，离心3-5min，弃上清液，保留菌体；反复洗涤2-4次；所述淬灭液是体积浓度为60％的甲醇水溶液；所述培养基2为：正十二烷2-5ml/L、葡萄糖72g/L、玉米浆12g/L、谷氨酸钠2.4g/L、豆粉18g/L，余量为水，调pH＝7.5，灭菌；

②提取细胞内代谢物：

取步骤①获得的细胞在研钵里加液氮研磨，称取40-50mg用液氮研磨好的细胞置于1.5mL离心管中，加入0.5-1mL温度为-30℃的提取液，涡旋混匀器充分混匀后液氮冻融2-4次得到冻融液；将冻融液在4℃，3000-5000rpm、离心3-5min，取上清液d至另一离心管中；下层细胞再加入0.5-1mL温度为-30℃的提取液，涡旋混匀器充分混匀后，4℃，8000-10000rpm、离心3-5min，取上清液e，将上清液d和e混合均匀，8000-10000rpm，4℃，离心3-5min，取260μL上清液f转至1.5mL离心管，加入50uL浓度为0.3mg·mL^-1琥珀酸-2,2,3,3-d₄水溶液，涡旋混匀器充分混匀后，-40℃条件下，真空冷冻干燥得样品，于超低温冰箱中保存；所述提取液为体积浓度为50％甲醇水溶液；

③代谢物衍生化

向步骤②获得的样品中加入50μL浓度为20mg·mL^-1的甲氧基铵盐酸盐的吡啶溶液，于40℃水浴中反应70-100min，加入80μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴反应20-60min，放入已编号的GC进样瓶中，室温静置2h；

④GC-MS检测

采用GC-MS对步骤③所得样品进行定性和定量处理，条件如下：

色谱柱：硅色谱柱，HP-5MS，30m×0.25mm，0.25μm；

进样量：1μL；；

分流比为1:10；

载气：高纯氦气，纯度：99.9995％；

进样口温度：280℃；

GC–MS接口温度：280℃；

氦气流速：恒压，91KPa；

升温程序：70℃保持2min，以5℃·min^-1的速度升到290℃，并在290℃保持3min，再降温到30℃；

电离方式：电子轰击电离；

离子电流：40μA；

电离电压：70eV；

源温：250℃；

扫描范围：50-800m/z；

扫描速度：2scan·s^-1；

从而获得了刺糖多孢菌的代谢物定性和定量数据；

⑤胞内代谢物定性定量分析

使用Mzmine对GC-MS的数据进行解谱和峰对齐，质谱峰通过AMDIS库进行去卷积，峰宽在2.0s以上，且信噪比高于10的峰就被认为是代谢物的峰,通过将质谱检测峰和商业化的质谱库NIST数据库比较，对所检测到的代谢物进行鉴定,通过内置的程序对总离子流图中的各个代谢物的峰进行自动积分并手动修正，从而得到内标物以及各个代谢物峰面积的数据,然后，将每种代谢物的特征离子的单位质量色谱图中定量的峰面积除以同一张谱图上的内标物琥珀酸-2,2,3,3-d₄的峰面积得以标准化，并计算每个代谢物的相对含量，即可得到每种代谢物的相对丰度；

(3)PLS分析

对(1)和(2)中获得的代谢物相对含量数据使用中心化和尺度化的方法进行预处理，然后使用SIMCA-P 11.5Demo软件对所得数据进行偏最小二乘判别分析；

(4)过程分析

将步骤(3)获得的代谢物标志物的含量按照培养条件差异制成图表，观察并分析这些代谢物变化的规律，进而发现在刺糖多孢菌产多杀菌素过程中起关键作用的代谢物及相关代谢网络，从而为以提高多杀菌素产量为目的的刺糖多孢菌培养条件提供优化方向。