[发明专利]基于代谢组学改进刺糖多孢菌发酵条件以提高多杀菌素产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物农药领域，具体涉及一种基于代谢组学改进刺糖多孢菌发酵条件以提高产多杀菌素产量的方法。

背景技术

多杀菌素又名刺糖菌素或者多杀霉素，是一种由刺糖多孢菌在有氧发酵条件下经次级代谢产生的大环内酯类抗生素，主要包括多杀菌素A(约占85％-90％)和多杀菌素D(约占10％-15％)两种化合物。多杀菌素作为一种高效广谱大环内酯类杀虫活性物质，由于其具有作用方式独特、杀虫谱广、半衰期短、杀虫活性高、无抗药性、残留低、环境污染少及对人畜无害等一些独特的物化性质、生物学特性和新颖的作用机制，被称为新一代的广谱绿色新型生物农药。

多杀菌素作为绿色新型环保生物农药已经得到广泛应用，国内外众多机构和研究人员开展了对刺糖多孢菌产多杀菌素的研究，其合成途径已逐渐被阐明。尽管如此，目前国内的研究仅停留在实验室阶段，并未实现产业化。研究表明，发酵过程中提高溶氧有助于多杀菌素产量的提高，但是对其相关代谢机制却仍不甚明了，这也在一定程度上成为多杀菌素工业化生产的绊脚石。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于代谢组学改进刺糖多孢菌发酵条件以提高多杀菌素产量的方法。

本发明的技术方案概述如下：

基于代谢组学改进刺糖多孢菌发酵条件以提高多杀菌素产量的方法，包括以下步骤：

(1)对刺糖多孢菌胞内的代谢物进行测定：

①细胞收集及淬灭：

在培养基1中对刺糖多孢菌进行发酵培养，在刺糖多孢菌发酵的对数期和稳定期,每个时期至少一个时间点取样5-10ml，每个时间点取样3-5份，将所取样品与18-20mL淬灭液混合均匀后放置5-10min，在3000-5000rpm，4℃，离心3-5min，弃上清液；用4℃蒸馏水洗涤除去细胞上的培养基成分；3000-5000rpm，4℃，离心3-5min，弃上清液，保留菌体；反复洗涤2-4次；所述淬灭液是体积浓度为60％的甲醇水溶液；所述培养基1为：葡萄糖72g/L、玉米浆12g/L、谷氨酸钠2.4g/L、豆粉18g/L，余量为水，调pH＝7.5，灭菌；

②提取细胞内代谢物：

取步骤①获得的细胞在研钵里加液氮研磨，称取40-50mg用液氮研磨好的细胞置于1.5mL离心管中，加入0.5-1mL温度为-30℃的提取液，涡旋混匀器充分混匀后液氮冻融2-4次得到冻融液；将冻融液在4℃，3000-5000rpm、离心3-5min，取上清液称上清液a至另一离心管中；下层细胞再加入0.5-1mL，温度为-30℃的提取液，涡旋混匀器充分混匀后，4℃，8000-10000rpm、离心3-5min，取上清液称上清液b，将上清液a和b混合均匀得上清液c，8000-10000rpm，4℃，离心3-5min，取260μL上清液c转至1.5mL离心管，加入50uL浓度为0.3mg·mL^-1琥珀酸-2,2,3,3-d₄水溶液，涡旋混匀器充分混匀后，-40℃条件下，真空冷冻干燥得样品，于超低温冰箱中保存；所述提取液为体积浓度为50％甲醇水溶液；

③代谢物衍生化

向步骤②获得的样品中加入50μL浓度为20mg·mL^-1的甲氧基铵盐酸盐的吡啶溶液，于40℃水浴中反应70-100min，加入80μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴反应20-60min，放入已编号的GC进样瓶中，室温静置2h；

④GC-MS检测

采用GC-MS对步骤③所得样品进行定性和定量处理，条件如下：

色谱柱：硅色谱柱，HP-5MS，30m×0.25mm，0.25μm；

进样量：1μL；；

分流比为1:10；

载气：高纯氦气，纯度：99.9995％；

进样口温度：280℃；

GC–MS接口温度：280℃；

氦气流速：恒压，91KPa；

升温程序：70℃保持2min，以5℃·min^-1的速度升到290℃，并在290℃保持3min，再降温到30℃；

电离方式：电子轰击电离；

离子电流：40μA；

电离电压：70eV；

源温：250℃；

扫描范围：50-800m/z；

扫描速度：2scan·s^-1；

从而获得了刺糖多孢菌的代谢物定性和定量数据；

(2)对刺糖多孢菌产多杀菌素能力进行分析：