[发明专利]一种水体游离基因污染物的浓集回收方法

说明书

技术领域

本发明属于环境生物技术领域，涉及一种水体游离基因污染物的浓集方法。

背景技术

核酸，作为生命物质的遗传学基础，在生物死亡后，有可能会释放到环境中并持久性残留。如果该生命为耐药细菌或转基因生物，不论其耐药基因或转基因成分是直接排入水环境中，还是经土壤或空气等其它途径传播，在地表径流或大气沉降作用下，这些游离的耐药基因或转基因成分会最终被迁移到河流、湖泊、水库等水环境中。因此，水环境是大气、土壤、食品等其他介质中耐药基因或转基因成分的“汇”，即水体是耐药基因或转基因成分的储存库。

传统认为，耐药基因或转基因成分只能在特定条件下才能水平转移到受体细菌体内，使该细菌获得耐药性或转基因成分。然而，近几年来，越来越多的报道显示，耐药基因或转基因成分在环境中的转移和传播具有一定特殊性，水质因素、特殊(微)环境、特殊物质均可能在一定条件下诱导转化或转导的发生，使耐药基因或转基因成分转移传播给其它微生物，而导致耐药性或转基因成分转移和传播。例如，生物膜，作为一种广泛存在的特殊水体微环境，其相对的空间稳定及细菌的紧密接触促进了细菌结合转移的发生；纳米颗粒，已经被报道不仅显著促进水中耐药基因的接合转移，而且还可显著促进耐药基因的转化和转导；另外，美国环境医学科学研究院已经确定，转基因成分可以在一定条件下转移到肠道微生物的核酸组成中；陈建等也发现，海河、珠江等地表水均存在一定程度的人工质粒来源耐药基因(转基因成分)污染。因此，游离耐药基因或转基因成分等基因污染物不仅已经成为国内外公认的新型环境污染物，而且其污染已成为重大公共卫生与生态安全问题。

然而，一般情况下，水环境中游离耐药基因或转基因成分等基因污染物含量非常少，远低于现有检测方法如PCR、荧光定量PCR的检测灵敏度。因此，若想有效地检测饮用水、地表水、回用水等各种水体中的基因污染物，首先必须对一定水样进行浓集处理，从不同水体中将少量的基因污染物浓集、回收出来，以供实验室和/或现场检测用。

目前，水中核酸(包括质粒)的浓集，主要采用沉淀法和吸附洗脱法。其中，沉淀法利用等体积乙醇、异丙醇等有机试剂，将水样中游离核酸或质粒沉淀出来，再通过离心而将核酸或质粒浓集；吸附洗脱法则利用硅胶柱，将水中的游离核酸或质粒吸附在硅胶材料表面,然后再利用洗脱液将其洗脱回收。这些方法虽快速、灵敏，但仅适于小体积，一般为几毫升(吸附洗脱法)到几十毫升(有机试剂沉淀法)的水样，而对于100毫升以上的大体积水样，这些方法均不适用，不仅消耗大量有机试剂，而且回收效率易受水质影响。目前，国内外均没有适于大体积水，尤其自来水、饮用水、地表水、回用水等各种水体中核酸，尤其游离基因污染物的浓集技术或方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从大体积的水体游离基因污染物的浓集回收方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种水体游离基因污染物的浓集回收方法，包括如下步骤：

(1)核酸吸附颗粒的制备：按比例，将12.6g的氯化铝缓慢加入至2L去离子水中，充分溶解后，加入2mol/L的碳酸钠水溶液90ml，混匀，调节pH＝7.2，形成凝胶；静置6～12h，除去上清，用0.14mol/L的NaCl水溶液洗涤凝胶2次后，再加入0.14mol/L的NaCl水溶液至2L，得到含水氢氧化铝凝胶，灭菌；将粒度在60～100目的层析用硅胶，经过蒸馏水淘洗除去漂在水面上的颗粒后，灭菌，按每300g灭菌后层析用硅胶加入0.5-1L含水氢氧化铝凝胶的比例，使灭菌后层析用硅胶浸透混匀，烤干，得到核酸吸附颗粒；

(2)洗脱液的配制：将15g氯化钠、30g胰蛋白胨、15g牛肉粉和3.75g甘氨酸加水至1L，用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH至9；

(3)将所述载核酸吸附颗粒装入长与直径比为5-35的过滤柱中并至过滤柱高度的2/3处；将待测水样以300-50毫升/分钟的速度匀速流过过滤柱后，再用洗脱液以40-50毫升/分钟的速度匀速流过过滤柱，用灭菌容器收集流出的洗脱液，即为游离基因污染物的一次浓集液；在无菌条件下，利用注射器将一次浓集液通过孔径为0.45微米的无菌滤器以除去细菌；除菌后的滤过液加入等体积无水乙醇或异丙醇并静置0.5-2小时后，离心收集沉淀；用2.5-50毫升的无菌双蒸水溶解沉淀，即为游离基因污染物的最终浓集液；所述待测水样与洗脱液的体积比为100：1-5。

待测水样的水源为自来水、纯净水、井水、回用水、二级出水、地表水或生活污水。

本发明的优点是

1.操作简便，不需要任何仪器设备；