[发明专利]基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统的应用。

背景技术

现有的细胞分选技术主要有以下两种：

①流式细胞分离技术

通过分离含有单细胞的液滴而实现的。将待测细胞与单克隆抗体和荧光染料结合后制成悬浮标本，在一定气体压力下样品进入流动室，在不含细胞的缓冲液包裹下单行排列。在流动室的超高频的压电晶体的高频振荡下，液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷，当带电液滴通过电场，在电场的作用下发生偏转，然后落入相应的收集器之中，从而实现细胞分选。

②免疫磁珠技术

磁珠表面包被具免疫反应性的抗体，与细胞表面的抗原进行特异性结合；后者置于强大的磁场下，就会与未结合的细胞分开；脱离磁场后会立即消失磁性，这样就可以筛选或去除所标记的细胞，从而达到筛选出阳性或阴性细胞的目的。其流程图如图1所示。

以上技术存在以下不足：流式细胞分离技术虽然可以分选得到目的细胞，但是①细胞必须能被荧光分子标记；②只能检测悬浮的单细胞；③分选过程不够温和，对细胞伤害大；④可能污染细胞；⑤不利于大体积样品的分选。免疫磁珠分选技术虽然可以通过正、负两种筛选获得目的细胞，但是①无法完成“一次结合”分离多种细胞；②如果需要从一个样品里面筛选多个目的细胞，需要多次结合和洗脱，得到的细胞活性差、得率低；③多次分选，成本高；④目的细胞与磁珠不能完全分离，不利于后续研究。

目前关于对细胞伤害小、可同时分选多种细胞、获得的目的细胞能够与载体彻底分离，适用于大量及脆弱细胞分选的技术还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统的应用。

本发明的再一的目的是，提供分选DC细胞、NK细胞和CIK细胞的试剂盒的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

基于核酸内切酶特异性识别的细胞分选系统在分选细胞中的应用，所述的分选系统包含以下组分：第一单链核苷酸、第二单链核苷酸、抗体、细胞分选介质、限制性内切酶；所述的第一单链核苷酸和第二单链核苷酸互补，且互补区域含有所述限制性内切酶的识别位点；所述的第一单链核苷酸、第二单链核苷酸、抗体、细胞分选介质均被修饰，修饰后的第一单链核苷酸可与修饰后的抗体相连接，修饰后的第二单链核苷酸可与修饰后的细胞分选介质相连接。

优选地，所述的第一单链核苷酸和第二单链核苷酸为部分序列互补或完全互补。

优选地，所述的第一单链核苷酸或第二单链核苷酸的长度为6bp-1kb。

更优选地，所述的第一单链核苷酸或第二单链核苷酸的长度为18bp-50bp。

优选地，所述的细胞分选介质是磁珠、分离柱或聚阳离子纳米颗粒。

更优选地，所述的第一单链核苷酸被巯基修饰，所述的第二单链核苷酸被生物素修饰，所述的抗体被顺丁烯二酰亚胺修饰，所述的磁珠被链霉亲和素修饰。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

分选DC细胞、NK细胞和CIK细胞的试剂盒在分选DC细胞、NK细胞和CIK细胞中的应用，所述的试剂盒包含以下组分：巯基与生物素修饰的三对单链核苷酸，CD3、CD56和HLA-DR抗体，链霉亲和素磁珠，限制性内切酶BamH I、EcoR I、Hind III。

所述的三对单链核苷酸的互补区域分别包含限制性内切酶BamH I、EcoR I、Hind III的识别位点。

优选地，所述的三对单链核苷酸的序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示。

本发明还涉及一种从细胞样品中分选目的细胞的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)合成互补的单链核苷酸，制备“磁珠/单链核苷酸”和“抗体/单链核苷酸”复合物；

b)在细胞样品中加入“抗体/单链核苷酸”复合物，形成“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物；

c)将“磁珠/单链核苷酸”复合物加入到“单链核苷酸/抗体/细胞”复合物中，形成“磁珠/双链核苷酸/抗体/细胞”复合物；

d)通过外加磁场的作用，磁性吸附目的细胞，去除非目的细胞；

e)针对不同的目的细胞，每次使用不同的限制性内切酶剪切含有特定识别序列的双链核苷酸，逐次洗脱不同的目的细胞。