[发明专利]一种乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法

说明书

本发明涉及一种乳或乳制品中酵母β‑葡聚糖的检测方法。具体而言，本发明的检测方法包括如下步骤：1)前处理步骤：用中性蛋白酶和碱性蛋白酶对乳或乳制品进行酶解，将酶解产物离心后用纯水或去离子水清洗离心后的沉淀，向沉淀中加入一元酸进行加热水解；2)分析步骤：采用离子色谱的方法测定前处理产物中葡萄糖的含量，计算乳或乳制品中酵母β‑葡聚糖的含量。

技术领域

本发明涉及一种分析检测方法，特别是一种乳或乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法。

背景技术

酵母β-葡聚糖(yeast beta glucan)是一种从酵母细胞壁中提取的葡萄糖聚合物，其分子结构主链包含β-1,3-D糖苷键，而支链包含β-1,6-D糖苷键，两者之比约为85:15。酵母β-葡聚糖的线性分子聚合度为1500、分子量约为240kDa，支链分子聚合度为140、分子量约为22kDa。酵母β-葡聚糖作为重要的食品膳食纤维来源，具有增强免疫力、防氧化辐射、抗肿瘤炎症、降低血脂胆固醇、促进伤口愈合等诸多营养价值和生理功能。2010年6月卫生部9号公告批准酵母β-葡聚糖作为新资源食品，2012年卫生部6号公告批准酵母β-葡聚糖用作食品添加剂(营养强化剂)。作为原料，酵母β-葡聚糖在食品和保健品中的应用更为广泛。饮用添加酵母β-葡聚糖的牛乳中可实现增强免疫力的功效。

由于酵母β-葡聚糖是一种水不溶性多糖，并与甘露聚糖、蛋白或几丁质等物质相互结合，其测定方法一直是个研究难点。目前，对酵母β-葡聚糖的测定多采用苯酚-硫酸法，但是此方法灵敏度较低，且易受其它多糖或单糖的干扰，造成测定结果不准确。为了改善测定结果的准确性，通常进行预处理。例如，可利用强酸将葡聚糖水解为葡萄糖的预处理方式，随后使用高效液相色谱法测定葡萄糖含量，从而间接计算葡聚糖含量([非专利文献1])。然而，该采用高效液相色谱法对葡萄糖进行分析时，由于葡萄糖在紫外区域无吸收，一般采用示差折光检测器和蒸发光散射检测器进行检测；虽然无需衍生，然而该方法的灵敏度很低，仅适合于常量样品的分析。此外，常用的氨基柱对多组分糖的分离效果有限。

相比之下，离子色谱法不仅能够分析阴阳离子，还能够过将非离子型化合物转变为离子型化合物的预处理，对非离子型化合物进行测定。例如，在非专利文献2中，在碱性条件下将酵母细胞壁中的β-葡聚糖和甘露寡糖解离成阴离子，经阴离子交换色谱柱分离，在脉冲安培检测器中发生氧化还原反应产生电流响应，从而检测β-葡聚糖和寡糖的含量。该测定方法具有显著的优点：样品前处理非常简单，不需要预先衍生就能分析几乎所有的单糖和大部分的寡糖及低聚糖；检测灵敏度极高，含量低至pmol级的样品亦可被检测。然而，该预处理方法需要采用200mmol/LNaOH中和葡聚糖水解液中剩余H₂SO₄，导致大量盐生成，对后续的离子色谱造成干扰。专利CN102809620A采用盐析法提取乳品中的酵母β-葡聚糖，乳液中的葡聚糖伴随蛋白盐析沉降与之形成共沉淀物。由于沉淀蛋白与挟裹入沉淀物中的乳糖和无机盐去除困难，检测受基质干扰严重，此外该方法前处理操作复杂、费时且受人为影响因素多，测定结果重复性不好，难以在实际样品测定中推广应用。

对于在乳或乳制品中添加酵母β-葡聚糖而言，由于在加工过程中采用高速剪切均质破碎乳品中的脂肪颗粒，不溶于水的葡聚糖颗粒也遭到破坏，导致葡聚糖固体粒径由最初的数十微米缩小至0.2至1.0μm，大部分集中在0.4至0.6μm，大小不均一且普遍被蛋白质包被。此外，乳品基质极其复杂，其中的脂肪球、蛋白束、稳定剂和香精配料都将影响对酵母β-葡聚糖的提取与纯化，因此如何准确测定乳和乳制品中的酵母β-葡聚糖仍是具有挑战性的课题。目前，只有AOAC 32.2.10标准《AOAC Official Method 995.16β-D-Glucan inBarley and Oats》和农业行业标准NY/T 2006-2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的测定》对水溶性β-葡聚糖的检测进行了标准化，但对于水不溶性β-葡聚糖，特别是乳和乳制品中的酵母β-葡聚糖，国内外均缺少的成熟的检测标准和相关技术。

[非专利文献1]：牛乳中酵母β-葡聚糖的应用与测定，付俊鹤等，《食品工业科技》2013年第4期；