[发明专利]支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法及其转化菌种在审
申请号: | 201410742206.1 | 申请日: | 2014-12-08 |
公开(公告)号: | CN104531738A | 公开(公告)日: | 2015-04-22 |
发明(设计)人: | 邱文英 | 申请(专利权)人: | 四川省华派生物制药有限公司 |
主分类号: | C12N15/66 | 分类号: | C12N15/66;C12N1/21;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/19 |
代理公司: | 北京方圆嘉禾知识产权代理有限公司 11385 | 代理人: | 董芙蓉 |
地址: | 641402 四川省资*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 支原体 pcr 检测 阳性 对照 质粒 制备 方法 及其 转化 菌种 | ||
1.一种支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法,其特征在于,该支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法包括以下步骤:
步骤一,支原体16s rRNA引物设计:
根据支原体16s rRNA的保守序列区设计一对引物,用于支原体16s rRNA保守序列区的扩增,引物序列如下:
上游引物5’-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCC-3’;
下游引物5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAAC-3’;
步骤二,16s rRNA的扩增及回收:
以支原体DNA为模板,用16s rRNA保守序列区引物进行PCR扩增,PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃预变性30s,53℃退火30s,共进行30个循环,最后于72℃延伸10min,结束反应后冷却至4℃;PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果,并用Takara胶回收试剂盒进行PCR产物的回收;
步骤三,阳性质粒及含阳性质粒的菌落的构建和鉴定:
纯化后的PCR产物与pGM-T载体连接,并将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞后,进行阳性克隆菌落的筛选,挑取白斑进行PCR鉴定,将鉴定为阳性的菌落培养12-16h后,采用质粒提取方法进行质粒的提取,并将鉴定为阳性的质粒进行测序;经测序为阳性的质粒命名为pGM-T-M.hyo。
2.如权利要求1所述的支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法,其特征在于,该支原体PCR检测的阳性对照质粒含猪源及鸡源支原体16sRNA序列的重组质粒pGM-T-M.hyo,用作生物制品支原体PCR检测时阳性对照。
3.一种支原体PCR检测的阳性对照质粒的转化菌种DH5α/pGM-T-M.hyo,其特征在于,该支原体PCR检测的阳性对照质粒的转化菌种为大肠杆菌重组菌,是由重组质粒pGM-T-M.hyo转化DH5α大肠杆菌而成。
4.如权利要求3所述的支原体PCR检测的阳性对照质粒的转化菌种,其特征在于,转化菌种用于重组质粒pGM-T-M.hyo的保存及克隆,按碱裂解法或者商品化质粒提取试剂盒进行质粒的提取,以获得重组质粒pGM-T-M.hyo。
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