[发明专利]支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法及其转化菌种

权利要求书

1.一种支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法，其特征在于，该支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法包括以下步骤：

步骤一，支原体16s rRNA引物设计：

根据支原体16s rRNA的保守序列区设计一对引物，用于支原体16s rRNA保守序列区的扩增，引物序列如下：

上游引物5’-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCC-3’；

下游引物5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAAC-3’；

步骤二，16s rRNA的扩增及回收：

以支原体DNA为模板，用16s rRNA保守序列区引物进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃预变性30s，53℃退火30s，共进行30个循环，最后于72℃延伸10min，结束反应后冷却至4℃；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，并用Takara胶回收试剂盒进行PCR产物的回收；

步骤三，阳性质粒及含阳性质粒的菌落的构建和鉴定：

纯化后的PCR产物与pGM-T载体连接，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞后，进行阳性克隆菌落的筛选，挑取白斑进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌落培养12-16h后，采用质粒提取方法进行质粒的提取，并将鉴定为阳性的质粒进行测序；经测序为阳性的质粒命名为pGM-T-M.hyo。

2.如权利要求1所述的支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法，其特征在于，该支原体PCR检测的阳性对照质粒含猪源及鸡源支原体16sRNA序列的重组质粒pGM-T-M.hyo，用作生物制品支原体PCR检测时阳性对照。

3.一种支原体PCR检测的阳性对照质粒的转化菌种DH5α/pGM-T-M.hyo，其特征在于，该支原体PCR检测的阳性对照质粒的转化菌种为大肠杆菌重组菌，是由重组质粒pGM-T-M.hyo转化DH5α大肠杆菌而成。

4.如权利要求3所述的支原体PCR检测的阳性对照质粒的转化菌种，其特征在于，转化菌种用于重组质粒pGM-T-M.hyo的保存及克隆，按碱裂解法或者商品化质粒提取试剂盒进行质粒的提取，以获得重组质粒pGM-T-M.hyo。