[发明专利]支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法及其转化菌种

说明书

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，尤其涉及一种支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法及其转化菌种。

背景技术

支原体是一种无细胞壁的原核微生物，其在自然呈广泛分布状态。支原体个体微小，直径约(0.1～0.8μm)，部分支原体可通过一般滤膜(0.22～0.45μm)。在生物制品的制备过程中，细胞培养及动物组织和鸡胚被广泛用于抗原的生产，而细胞、组织及鸡胚极易受到支原体的污染。有研究表明，在细胞培养过程中，支原体的感染发生率达到30～60％。细胞及动物组织感染支原体后，不能通过可视法对其进行检测，但是其会影响细胞的生长及病毒的繁殖等，导致生物制品品质下降。使用被感染的细胞、组织及胚胎等制备的生物制品中存在成为支原体的潜在传播源。由于人及动物所造成的危害已逐渐明确，因而引起了人们的高度重视。根据生物制品的产品质量要求，特别是疫苗类生物制品必须不含支原体。目前疫苗成品支原体检测多采用支原体培养物，但是支原体在分离培养对营养要求较高，初代分离较困难，另外支原体生长缓慢，因此会耗费大量的人力和物力。为了严格控制生物制品中的支原体污染，对原辅材料、细胞、组织、胚胎及半成品进行常规监测尤为重要，然而采用常规培养法需要耗费29天时间，这会严重影响到正常生产的进行及产品的生产。鉴于此，目前大多生产企业及科研院校采用灵敏度、耗时短的PCR的方法对原辅材料等进行辅助性检测。

在PCR检测中，为了确定试验的可行性，必须在阳性对照及阴性对照成立的情况下对PCR检测结果做出判断。阳性对照是通过含支原体的材料进行DNA抽提而得到，这有可能导致检测环境中支原体污染的现象，使检测结果呈假阳性，从而做出错误的结果判断。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法及其转化菌种，旨在解决PCR检测的阳性对照是通过含支原体的材料进行DNA抽提而得到，有可能导致检测环境中支原体污染的现象，使检测结果呈假阳性，从而做出错误结果判断的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法，该支原体PCR检测的阳性对照质粒的制备方法：包括以下步骤：

步骤一，支原体16s rRNA引物设计：

根据支原体16s rRNA的保守序列区设计一对引物，用于支原体16s rRNA保守序列区的扩增，引物序列如下：

上游引物5’-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCC-3’；

下游引物5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAAC-3’；

步骤二，16s rRNA的扩增及回收：

以支原体DNA为模板，用16s rRNA保守序列区引物进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃预变性30s，53℃退火30s，共进行30个循环，最后于72℃延伸10min，结束反应后冷却至4℃；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，并用Takara胶回收试剂盒进行PCR产物的回收；

步骤三，阳性质粒及含阳性质粒的菌落的构建和鉴定：

纯化后的PCR产物与pGM-T载体连接，并将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞后，进行阳性克隆菌落的筛选，挑取白斑进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌落培养12-16h后，采用质粒提取方法进行质粒的提取，并将鉴定为阳性的质粒送往上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序；经测序为阳性的质粒命名为pGM-T-M.hyo。

进一步，该支原体PCR检测的阳性对照质粒含猪源及鸡源支原体16sRNA序列的重组质粒pGM-T-M.hyo，用作生物制品PCR检测时阳性对照。

本发明实施例的另一目的在于提供一种支原体PCR检测的阳性对照质粒的转化菌种DH5α/pGM-T-M.hyo，该支原体PCR检测的阳性对照质粒的转化菌种为大肠杆菌重组菌，是由重组质粒pGM-T-M.hyo转化DH5α大肠杆菌而成。

进一步，转化菌种用于重组质粒pGM-T-M.hyo的保存及克隆，通过常规质粒提取方法可获得重组质粒pGM-T-M.hyo。