[发明专利]一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法

权利要求书

1.一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，包括以下步骤：

(1)提取盐生植物叶片DNA作为供体；

(2)取水稻9311、盐恢559、7海76、7海74作为受体，在盛花期选择正在开花的稻穗，去除未开过的颖花和已开过的颖花，每穗只留下当天刚开的颖花约20朵；1.5～2.0小时后剪去小穗内颖，并将1/3～1/2的花柱连同柱头一起剪去；立即用微量注射器在刚剪去柱头的花柱切面上滴注含芦苇DNA溶液2～3μl；注射时间为水稻开花后1～3小时进行，芦苇DNA溶液浓度是100～500μg/ml，导入量是10-20μl，套上杂交袋以防止水份蒸发，25～30天后收获D₀代种子；

(3)收获的D₀代种子全部播种，经观察，各导入系基本无变异或变异不明显，分别全收各株的种子为D₁代种子；

(4)将D₁代种子分为两组，第一组在含盐分浓度为5‰的塑料盆中进行种子发芽和育苗，对种子进行耐盐性筛选，选留健壮幼苗移栽到普通无盐大田，进行常规栽培，观察变异情况，选留生长正常的单株收种；第二组种子则种植于普通水田内发芽和育苗以及全过程生长，选留变异株，进行单株收种；盐筛和非盐筛所选留的各单株收种称为D₂代种子；

(5)将收获的D₂种子再在盐池盐度为4‰～5‰的条件下进行耐盐性筛选，以未导入外源DNA的受体作为对照，进行水稻生长的耐盐性和产量品质性状的筛选鉴定，筛选生长正常的单株，收获D₃代种子；

(6)将收获的D₃代种子在盐池盐度为4‰～5‰的条件下进行耐盐性筛选，以未导入外源DNA的受体作为对照，进行水稻生长的耐盐性和产量品质性状的筛选鉴定，筛选生长正常的单株，收获D₄代种子；

(7)在盐池盐度为5‰的条件下进行多代筛选，直至D₆代植株基本稳定；

(8)同时，培育出与双8S/海湘4号C815S杂交获得F₁代植株；

(9)将收获的D₆代株系的种子与获得的F₁代单株种子分别在盐分为2‰和4‰、6‰不同梯度的江苏盐城滩涂盐地中进行田间试种，以未导入外源DNA的受体作为对照，选育出耐盐性高、生长好、产量高的新品种或新品系，；

(10)次年，将新品系或新品种在盐分为3‰-4‰的江苏盐城滩涂盐地中进行50亩“耐盐水稻高产示范区”中展示，以未导入外源DNA的受体作为对照，进行水稻生长的耐盐性和产量品质性状的筛选鉴定。

2.根据权利要求1中所述的一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，其特征在于：通过CTAB法提取盐生植物叶片DNA。

3.根据权利要求1或2中所述的一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，其特征在于：所述盐生植物为芦苇。

4.根据权利要求3中所述的一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，其特征在于：所述注射时间为水稻开花后1～3小时。

5.根据权利要求4中所述的一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，其特征在于：所述芦苇DNA溶液浓度是250～300μg/ml。

6.根据权利要求5中所述的一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，其特征在于：向芦苇DNA溶液中加入100～200μg/ml的非功能运载DNA。

7.根据上述1至6中所述的方法得到的耐盐水稻新品种或新品系的新的DNA片段，其特征在于：所述编码序列为序列表1中所示。