[发明专利]一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种培育耐盐水稻的方法，属于植物育种技术领域，更具体地说是一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法。

背景技术

土壤的盐渍化是影响农业与生态环境的一个严重问题。我国的耕地总面积19.5亿亩，其中20％存在着不同程度的盐渍化和次生盐渍化，滩涂共计1.4亿多亩。此外还有5.2亿亩内陆盐碱化土壤，其中盐碱地1.5亿亩。人们曾试图通过合理的排灌、淡水洗涤、施用化学改良剂等方式来改造盐碱地,但常因耗资巨大,见效少而难以推广。于是把目光转向发掘和培育耐盐作物方面。国内外在培育耐盐水稻新品种方面，主要集中在两个方面：

一是对地方农家水稻品种进行筛选，驯化成具有经济价值的耐盐品种，但由于水稻品种具有特殊多样化的生态条件，适应性相对较窄的特点，因此筛选出来的耐盐资源大多没能在实践中得到有效利用，更没有进入盐碱地区进行生产应用，目前，我国沿海滩涂和盐碱地主要是中低产田，适合我国种植的耐盐水稻很少，水稻亩产量只有200公斤左右。

二是随着分子生物学技术的发展,借助生物技术和杂交育种，改造并提高水稻的耐盐性，培育耐盐新品种日益成为热点。目前已有一些导入单个基因提高植物耐盐性的报道,如通过基因工程手段，使植物细胞产生和积累某些低分子有机化合物，如甜菜碱、脯胺酸、糖醇类等以维持渗透势平衡和体内水分，能在一定程度上提高植物的耐盐性，但目前大多还处于实验室研究阶段。突出的例子是陈受宜等转入甜菜碱脱氢酶(BADH)基因的水稻，经盐胁迫筛选得到转化植株在0.5％NaCl的盐池中多数生长基本正常,但结实率仅为10％。目前还没有得到真正意义上的耐盐水稻作物，其原因主要是植物的耐盐机制十分复杂,是一种数量性状，受多基因控制，因此转移单个基因往往只能获得部分耐盐性,要获得具有经济价值的耐盐作物可能需要同时转移多个基因，而目前在识别和分离耐盐基因以及同时操作多个基因方面尚有很大困难。

自从上世纪50年代联合国教科文组织提出耐盐植物开发研究的方向以来，盐土农业作为一种新兴的农业模式正在逐渐兴起。2013年4月，国际水稻研究所称，通过野生稻种杂交已经培育出一种新型耐盐水稻，可以在海水侵蚀的滨海土地种植，但目前仍处于对品种性能进行改进和评定的阶段，若要田间试种至少还需4到5年(参见Salt-tolerant rice bred at Philippines institute Apr 16,2013)。日本理化学研究所尝试用重离子培育耐盐水稻，但目前也还处于实验室研究阶段。另有报道，泰国国家遗传工程和生物技术中心植物细胞技术实验室的主任Chalermpol Kirdmanee2001年在实验室中发现了4株能耐2％NaCl的泰国香水稻，但是一直没有关于最新进展的后续相关报道(参见Transcriptional regulations of the genes of starch metabolism and physiological changes in response to salt stress rice(Oryza sativa L.)seedlings)，2005年中国科学院上海生科院植物生理生态所宣布:水稻耐盐功能基因研究在沪取得重大突破性进展。该所与美国专家合作,成功克隆了与水稻耐盐相关的数量性状基因，但距离实际应用尚需时日。

发明内容

本发明的目的是提供一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，该方法中运用花粉管通道技术将盐生植物的总DNA转移，实现超远缘遗传物质的转移，能同时导入多个基因，达到耐盐植物分子育种的目的。

本发明为一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，包括以下步骤：

(1)提取盐生植物芦苇叶片DNA作为供体；

(2)取水稻9311、盐559、7海76、7海74作为受体，在盛花期选择正在开花的稻穗，去除未开过的颖花和已开过的颖花，每穗只留下当天刚开的颖花约20朵；1.5～2.0小时后剪去小穗内颖，并将1/3～1/2的花柱连同柱头一起剪去；立即用微量注射器在刚剪去柱头的花柱切面上滴注含外源DNA溶液2～3μL；注射时间：水稻开花后1～3小时进行，DNA溶液浓度是250～300μg/ml,导入量是10-20μl，套上杂交袋以防止水份蒸发，25～30天后收获D₀代种子；

(3)收获的D₀代种子全部播种，经观察，各导入系基本无变异或变异不明显，分别全收各株的种子为D₁代种子；