[发明专利]一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，包含扩增预混液、阴性对照，其特征在于：还包含有阳性对照、序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2的扩增引物和序列SEQ ID NO.3的探针引物的混合物。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述序列SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.2为：

SEQ ID NO.1：上游引物TTAATTGATTGGGCTGATGGTCT， 

SEQ ID NO.2：下游引物GCTGCCGGCAATGATGTCTC。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT- PCR试剂盒，其特征在于：所述探针引物序列为：

SEQ ID NO.3：GTTCTTGACATCGGGTATTTCCGGGAC。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述序列SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.2的扩增引物和序列SEQ ID NO.3的探针引物浓度均为10pmol/μL，扩增引物及探针引物配比为1:1:1。

5.根据权利要求1或2所述的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT- PCR试剂盒，其特征在于：所述扩增引物扩增出的条带序列为：

序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2的由5’端向3’端延长的序列；

SEQ ID NO.4（176 bp）：

TTAATTGATTGGGCTGATGGTCTAGAGTTCTTGACATCGGGTATTTCCGGGACCCGCAAGATTTTCCCGCCTTGGAATCTTCCTCCTTTACTCTTCTGGGAGTTAAGAACTTCTTGAATGTCATCACCTTCTAATTTTTCGACTTCTGTTGACCTAGAGACATCATTGCCGGCAGC。

6.根据权利要求1所述的一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为构建的pGM-176阳性质粒以及利用其制作的标准曲线，该质粒是扩增引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所扩增的小反刍兽疫病毒基因序列，长度176bp，克隆至pGEM-T Easy克隆载体，筛选为阳性的命名为pGM-176。

7.根据权利要求1所述的一种用于小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒组分的配比为： 

a. 2×One Step RT-PCR buffer III：25份；

b. Ex Taq HS：1份；

c. PrimerScript RT Enzyme Mix II：1份；

d.引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液6份，176bp上游引物2份，176bp下游引物2份，探针引物2份；

e. 无RNA酶水11份；

f. 阳性对照pMD-176阳性质粒6份；

g. 阴性对照无RNA酶水6份。

8.一种如权利要求1所述用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：

a．使用权利要求1所述的检测试剂盒进行PCR扩增，条件如下： 94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度54℃ 30s，72℃ 20s，40个循环；

b. 结果分析；

根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测；再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。