[发明专利]一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒

说明书

  

技术领域

本发明涉及小反刍兽疫防治技术领域，具体说是一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR（探针法实时-定量聚合酶链反应）试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。

背景技术

小反刍兽疫（Peste des petits Ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒(Peste  des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种严重的传染病，主要感染小反刍动物，特别是山羊高度易感。该病毒是副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbolivirus)的成员，同属的其他成员还有牛瘟病毒(Rinderpest virus,

RPV)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise distemper virus，PDV)等。PPRV主要侵害淋巴组织及消化道上皮组织，以突然发热、眼鼻排出分泌物、口腔溃疡、呼吸失调、咳嗽、恶臭的腹泻和死亡为特征。本病1942年首次报告发生于西非之象牙海岸，1972年正式确认病原为反刍兽疫，PPRV有4个群，但只有1个血清型。目前已确认发生的国家有象牙海岸、贝宁、多哥、尼日利亚、塞内加尔、加纳、马里、尼日尔、冈比亚、毛里塔尼亚、乍得、苏丹、沙特阿拉伯、阿曼、约旦、以色列、印度、孟加拉国。近几年该病在我国的周边国家频频发生，特别是2007年首次在我国西藏发现该病后，2003年年底至今， PPR在我国新疆、内蒙、甘肃、安徽等地流行非常严重，现已严重威胁到我国小反刍动物的健康。本病流行猖撅，发病率和死亡率均很高，对山羊生产和畜牧经济造成严重损失。被世界动物卫生组织（OIE）[《国际动物卫生法典》(1999)]动物卫生法典列为必须报告的动物疫病，我国《法定动物疫病病种名录》中将其列为I类动物疫病。小反刍兽疫严重破坏畜牧业生产，造成了动物及其产品的国际贸易障碍，所带来的巨大经济损失不可估量。快速准确的诊断是控制和扑灭小反刍兽疫至关重要的一个环节。

常规的病原学诊断方法主要有病毒的分离与鉴定、病毒抗原检测等，每种诊断方法都有其适用的范围。用常规病原学方法对血液、淋巴结、脾脏等病毒含量低微的样品进行检测，往往得不到正确的结果。分子诊断方法是一种敏感的新技术，RT-PCR技术已广泛应用于生命科学的各个领域，它具有敏感、特异和操作快速简便等特点，能使原本诊断十分困难的某些传染病和遗传病在分子水平上得到确诊。近年来，该方法在PPRV的研究与诊断上已得到了应用，但在检测PPRV隐性感染和肉品检疫等方面仍有不足之处。Real-Time RT-PCR是在常规RT-PCR方法的基础上，除了常规PCR的扩增以外，还额外增加了一条探针引物，只有在探针引物的有效结合下，才能产生有效扩增，因此检测的特异性和敏感性大大提高。不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

本发明针对目前的现状，在长期研究的基础上，建立并优化出一种简捷、廉价、敏感的Real-Time RT-PCR PPRV检测方法，并组装成试剂盒。该方法无需体外单独进行反转录，在同一反应管内就可完成反转录和PCR的过程，通过荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，结果更为准确直观，且无需电泳观察结果。大大缩短了时间和减少了污染的机率，保证了我国对PPRV的诊断与国外检测方法的一致性。该方法具有以下特点：特异性好：与牛瘟、口蹄疫、羊痘、羊口疮等无交叉反应，假阳性率低于2%；敏感性高：可检测到100个拷贝数的病毒；稳定性强：在12个月内检测数据稳定可靠；该方法与国外同类产品相比符合率大于90%。该方法应用的可行性强，对我国小反刍尤其羊免受PPR的威胁，提高农村养羊户收入，促进国际贸易增长等均具有极其重要的现实意义和社会意义。已成为病原体检测的重要方法。

本发明通过反复试验以及引物浓度和探针浓度的优化，（1）制作标准曲线的相关系数R2大于0.98；斜率位于-3～-3.5之间；PCR扩增效率E位于0.9～1.2之间，符合线性关系、扩增效率要求；（2）35Cycles内可得到好的定量结果，符合灵敏度要求；（3）阴性对照35 Cycles内无引物二聚体产生，符合阴性要求。因此，该方法以其快速、灵敏、特异、定性、定量、低污染率等特点优于普通PCR方法。

发明内容