[发明专利]一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法

说明书

技术领域

本发明属于家畜病毒检测技术领域，具体涉及一种新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法。

背景技术

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病，死亡率极高，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟已被世界动物卫生组织(OIE)列为家畜A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。临床以稽留高烧、皮肤和黏膜出现大量出血点为特征。多年的实践经验证明，疫苗接种是预防和控制动物疫病的主要手段。20世纪60年代，我国研制出经人工诱变获得的猪瘟兔化弱毒株(又称C株)疫苗在CSFV防控中起到了决定性作用，有效的控制了猪瘟在我国乃至世界范围内大规模的流行。因此，疫苗的质量至关重要，疫苗效价是评价疫苗质量的关键指标。

到目前为止，对于猪瘟活疫苗中病毒含量测定还没有一种稳定性、重复性好的定量方法，还不能进行病毒含量测定。过去，一直采用兔体定型热反应法来检测疫苗效力。但是该方法周期长，兔体个体的反应会影响结果的稳定性。近几年，一些学者采用实时荧光定量PCR方法快速检测猪瘟活疫苗中病毒含量(Hoffmann B,et al.Validation of a real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever.J Virol Methods，2005，130(1-2)：36-44；高博,等.快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立应用。西南民族大学学报：自然科学版，2009，35(1)：92-97)和RT-PCR方法(罗廷荣,等.RT-PCR诊断CSFV的应用研究.中国预防兽医学报，2003，25(3):219-222),这些方法虽然灵敏度很高，但都不能进行完全定量，并且不能区分活疫苗中有复制能力的活病毒粒子和死亡的病毒粒子，因此，实时荧光定量PCR方法和RT-PCR方法不能对疫苗中活病毒进行定量。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫中病毒含量测定方法，可以更灵敏、更特异的检测到该疫苗中的活病毒的含量，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于检测猪瘟病毒的荧光免疫检测试剂盒，包含有如下的组分：

1)一抗：用于检测CSFV的单因子血清抗体；

2)二抗：FITC标记的山羊抗兔IgG；

3)阳性对照样品：猪瘟兔化弱毒株(C株)；

4)固定液：按丙酮与甲醇体积比1：1配置固定液；

5)PBS洗液:Nacl 8.0g/L；Kcl 0.2g/L；Na₂HPO₄3.58g/L；KH₂PO₄0.24g/L。

其中兔抗CSFV蛋白的单因子血清抗体，其制备方法如下：将CSFV基因重组腺病毒载体疫苗强化免疫SPF兔后，用猪瘟兔化弱毒株进行攻毒，选择攻毒后无反应热的SPF兔采集血清制备的。

上述的试剂盒用于检测猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗中的病毒含量；其一种具体操作步骤如下：通过将猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗进行连续10倍梯度稀释，在培养板每孔逐滴取100μl稀释的疫苗液接种于在5％CO₂、37℃孵育2～3小时的HEK293细胞上，继续培养48小时后，利用构建的检测CSFV的荧光免疫检测试剂盒进行间接免疫荧光检测，通过计算显微镜下视野中阳性(出现绿色荧光)细胞的平均个数计算疫苗中的病毒含量。

其中计算病毒含量的方法如下：

1)计算显微镜下视野中阳性细胞的平均个数。选择一个梯度，此梯度视野中有5-50个阳性细胞，随机选择至少5个区域计数；

2)计算24孔板中每孔视野数；

对于多数显微镜，标准10×目镜与10×物镜所观察到的视野直径为1.8mm，因此：每个视野的面积＝3.14×(D/2)²＝3.14×0.9²＝2.54mm²；对于一个标准24孔板，培养面积为2.0cm²，因此：每孔视野数＝2.0cm²/2.54mm²＝2.0cm²/2.54×10^-2cm²＝79；