[发明专利]多重核酸位点检测方法

权利要求书

1.一种用于检测样品中两个或两个以上靶核酸待测位点的目标碱基的方法，其包括以下步骤：

(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游外引物、下游外引物和两组或两组以上上游内引物、下游内引物和探针，

其中，每组上游内引物、下游内引物和探针中:

所述上游内引物的3’端为上游内引物靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与对应的靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应该靶核酸的待测位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与对应的靶核酸的所述待测位点目标碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为上游外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与对应的靶核酸的序列不互补；

所述下游内引物的3’端为下游引物靶序列识别片段，其核苷酸序列与对应的靶核酸的序列互补，所述下游引物的5’端为下游外引物重叠片段，其序列与靶核酸的序列不互补；

其中所述两组或两组以上的上游内引物和下游内引物中各组的上游外引物重叠片段的序列相同，以及各组的下游外引物重叠片段的序列相同；

其中所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭，所述探针可特异性与所述上游内引物和下游内引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交，并且所述探针中，其5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段的长度与所述上游内引物的靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸，

以及，

其中所述上游外引物的3’端为上游引物重叠片段，其与所述上游内引物的5’端的所述上游外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

所述下游外引物的3’端为下游引物重叠片段，其与所述下游内引物的5’端的所述下游外引物重叠片段相同，所述下游外引物的5’端与靶核酸不互补；

(b)实施多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤；测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。

2.权利要求1的方法，其中所述上游内引物为ARMS引物，其3’端末端的第二至四个核苷酸与对应的靶核酸序列有至少一个核苷酸的错配，优选的，所述错配是在3’端末端第二个核苷酸。

3.权利要求1或2的方法，其中所述探针的核苷酸序列与以所述待测位点为目标碱基的靶核酸为模板的所述上游内引物和下游内引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段互补。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述探针的5’端末端至包含对应所述突变的位点的片段的序列与所述上游内引物的靶序列识别片段相同。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中样品中所述两个或两个以上待测位点目标碱基可位于一条靶核酸上，或是位于不同的靶核酸上。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤a)中所述含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物是一个混合物。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述两组或两组以上上游内引物、下游内引物和探针中各个探针标记的报告基团相同或不同。

8.权利要求1的方法，其中步骤(b)中所述多个循环扩增步骤包括第一扩增阶段和第二扩增阶段，在第一扩增阶段中可得到以靶核酸为模板，由对应的上游内引物与下游内引物限定的扩增产物，第二扩增阶段中可得到以第一扩增阶段得到的扩增产物为模板，由上游外引物与下游外引物限定的扩增产物。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中在所述核酸延长步骤测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述探针中对应靶核酸待测位点的碱基的位置位于所述探针中间。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述聚合酶具有5’→3’外切活性，更优选的，所述聚合酶没有3'→5'外切酶活性。