[发明专利]多重核酸位点检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测领域。更具体地说，本发明涉及使用通用引物和多组非通用引物与荧光探针在样品中检测多重目标核酸位点碱基的方法。

背景技术

现代分子诊断领域中，尽量在少量的检测样品中多种核酸内容物中的微小差异是一项重要的工作，而且希望能够在简化的程序和操作中能针对各种类型的病毒或细菌同时做检测。

使用荧光探针监测核酸扩增反应的方法是本领域已知的。基于PCR的分析的自动化系统可利用PCR过程期间对产物扩增给出的荧光信号进行实时检测。这类方法的关键是使用携带报告基团或标记物的经修饰的寡核苷酸。

检测少量核酸最常用的方法是PCR或RT-PCR。在测定给定样品中目标序列与否存在，即定性分析时，这些方法起到了重要的作用。同样的，核酸的定量分析在例如质量控制、基因表达分析、医疗监护以及诊断中大量使用。然而，现有的荧光双标记探针的使用存在相关的缺陷。例如需要使用大量昂贵的荧光标记的寡核苷酸(包括引物和/或探针)，引物和/或探针设计复杂。

因此，本领域还需要一种更简化并且尽量避免假阳性问题的PCR检测方法，而且希望能够在尽量少的程序和操作中能针对各种类型的病毒或细菌同时做检测。本发明的方法通过通用引物和多组非通用引物与荧光探针，实现对多重目标的检测以及实现双重验证，能够大大增强检查结果的真实性。本文所述方法显著改善了现有技术的核酸检测方法的精确度。

发明内容

本发明的方法通过采用通用引物和多组非通用引物与荧光探针，实现对多重目标的检测以及实现双重验证，能够大大增强检查结果的真实性。

具体的，本发明提供了一种用于检测样品中两个或两个以上靶核酸待测位点的目标碱基的方法，其包括以下步骤。

步骤(a)，向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游外引物、下游外引物和两组或两组以上上游内引物、下游内引物和探针。

在本发明的方法中，样品中所述两个或两个以上待测位点目标碱基可位于一条靶核酸上，或是位于不同的靶核酸上。例如，所述两个或两个以上待测位点可以是位于一条靶核酸上的不同位点，也可以是位于两条或两条以上靶核酸上的同一位点或不同位点。

在本发明的一个方面，所述方法是一锅法，即所述含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物是一个混合物(即一个反应体系，例如所述测试发生在一个容器中)。在本发明的其它方面，所述方法也可以在两个或以上混合物中进行(即多个反应体系，例如所述测试发生在多个容器中)。

在本发明中，聚合酶是DNA聚合酶，参与DNA复制。它主要是以模板为基础，催化去氧核糖核苷酸的聚合。聚合后的分子将会组成模板链并再进一步参与配对。本发明使用的聚合物具有5'→3'的聚合酶活性。所述聚合酶具有5’→3’外切酶活性。5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部份(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。在本发明的其中一个方面，使用的聚合酶没有3'→5'外切酶活性。可用于本发明的方法的聚合酶包括TaqDNA聚合酶，TthDNA聚合酶等。

在本发明的其中一个方面，在上述本发明的方法的步骤(a)中，，每组上游内引物、下游内引物和探针对应所述两个或两个以上靶核酸的待测位点目标碱基中的其中一个。在本发明的其中一个方面，针对所述两个或两个以上靶核酸的待测位点目标碱基中的其中一个提供一组对应的上游内引物、下游内引物和探针。在本发明的其它方面，也可以针对一个靶核酸的待测位点目标碱基提供一组以上的上游内引物、下游内引物和探针。

在所述每组上游内引物、下游内引物和探针中：

所述上游内引物的3’端为上游内引物靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与对应的靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应该靶核酸的待测位点，该靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点目标碱基互补(即与双链靶核酸中另一条单链上的待测位点的碱基相同)。所述靶序列识别片段与在待测位点的碱基不为目标碱基的靶核酸不能杂交。在本发明的其中一个方面，所述靶序列识别片段的核苷酸序列与靶核酸的序列完全互补。在本发明的另一个方面，所述靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点目标碱基互补，其它碱基与靶核酸可以有1％，2％，3％，5％的错配，其前提是，具有所述错配的靶序列识别片段与靶核酸可以杂交，但与在待测位点的碱基不为目标碱基的靶核酸不能杂交。