[发明专利]一种蛋白质N-端富集方法及其应用有效

专利信息
申请号: 201410747402.8 申请日: 2014-12-09
公开(公告)号: CN105738169B 公开(公告)日: 2018-09-21
发明(设计)人: 张丽华;陈玲凡;单亦初;杨开广;张玉奎 申请(专利权)人: 中国科学院大连化学物理研究所
主分类号: G01N1/28 分类号: G01N1/28;G01N30/08
代理公司: 沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002 代理人: 马驰
地址: 116023 *** 国省代码: 辽宁;21
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摘要:
搜索关键词: 一种 蛋白质 富集 方法
【权利要求书】:

1.一种蛋白质N-端富集方法,包括:

蛋白质样品去除自身的磷酸化翻译后修饰后,通过选择性的胍基化反应封闭蛋白质样品的侧链氨基,然后对蛋白质剩余的N-端氨基进行磷酸根标记,对标记的蛋白进行酶解后,采用二氧化肽亲和富集带有磷酸根标签的N-末端肽段。

2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:

取蛋白提取液于3000-10 000 Da超滤膜上,将背景溶液置换成1×蛋白金属磷酸酶反应缓冲液,加入蛋白酶抑制剂cocktail和终浓度为0.5-5 mM的氯化锰, 混合均匀后加入λ蛋白磷酸酶(λ-PPase),于25-50 °C温育1-5 h, 得到溶液A;蛋白酶抑制剂Cocktail 加入量占溶液A的体积百分数范围为0.1%-5%。

3.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:选择性胍基化反应封闭蛋白质样品的侧链氨基,其特征在于:

于超滤膜上,将蛋白质样品去除自身磷酸化后进行变性、还原、烷基化后,采用氢氧化钠调节pH至9-12,加入O-甲基异脲和盐酸胍,或者加入O-甲基异脲和尿素,于4-37 °C振荡反应4-36 h,得溶液B。

4.按照权利要求3所述的方法,其特征在于:所述O-甲基异脲的终浓度范围为0.1-2 M,盐酸胍或尿素的终浓度范围为1-6 M。

5.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的对蛋白剩余的N-端氨基进行磷酸根标记,其具体步骤如下:

选择性胍基化反应封闭蛋白质样品的侧链氨基后将溶液pH调节至6-9,加入能与氨基反应且含磷酸根的试剂,保持溶液中的尿素或盐酸胍终浓度为1-6 M,于10-60 °C振荡反应2-12 h;将超滤膜上的溶液进行离心,采用10-100mM的碳酸氢铵进行溶液置换,以去除残余的试剂,得到溶液C;

于溶液C中加入蛋白水解酶,于25-37 °C中孵育6-24 h后除盐备用。

6.按照权利要求5所述的 方法,其特征在于:所述的能与氨基反应且含磷酸根的试剂的终浓度为10-1000 mM;当采用带磷酸根的醛基试剂时,另加入终浓度10-600 mM的氰基硼氢化纳。

7.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的亲和富集带有磷酸根标签的N-末端肽段具体步骤如下:

对蛋白质剩余的N-端氨基进行磷酸根标记并对标记的蛋白进行酶解后,采用上样溶液将样品重溶后,将样品上样至金属氧化物或固定化金属离子材料上,材料与蛋白重量比为5-100,用清洗溶液去除非特异性吸附后,然后采用洗脱溶液对富集到的标有磷酸根的N-端肽段进行洗脱,并除盐冻干。

8.按照权利要求7所述的方法,其特征在于:所述的金属氧化物为二氧化钛,二氧化锆,三氧化铝中的一种,固定化金属离子材料为固定化铁离子,固定化锆离子,固定化铝离子中的一种;

其中样品上样溶液为:体积浓度30-50%乙腈+0.1-5%三氟乙酸,其余为水;清洗溶液分别为体积浓度30-80%乙腈、体积浓度0.1%-5%三氟乙酸的混合溶液;洗脱溶液为质量浓度5%-15%氨水。

9.按照权利要求5所述的方法,其特征在于:采用的蛋白水解酶为胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,木瓜蛋白酶,弹性蛋白酶,胃蛋白酶,或内肽酶Glu-C。

10.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:其可用于简单及复杂样品中蛋白N-端的测序,蛋白异构体的鉴定,以及水解酶水解底物及位点的鉴定。

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