[发明专利]一种蛋白质N-端富集方法及其应用

说明书

本发明涉及一种蛋白质N‑端富集方法，包括：选择性胍基化标记、磷酸根标记、磷酸根亲和材料富集。蛋白质样品首先采用碱性磷酸酶去除磷酸化翻译后修饰，然后在强碱性条件下对蛋白侧链氨基进行选择性的胍基化标记封闭侧链氨基，剩余的蛋白末端氨基采用带有磷酸根的氨基活性试剂进行标记使末端带上磷酸根标签，对标记的蛋白进行酶解，最后采用磷酸根亲和富集材料吸附带有磷酸根标签的N‑端肽段，从而得到蛋白质N‑端。本发明的优点是高效的胍基化、磷酸根标记和亲和材料富集，使得蛋白N端的富集具有优异的富集效率与选择性。

技术领域

本发明涉及一种蛋白质N-端富集方法，实现蛋白N-端高效高选择性富集。

背景技术

蛋白质末端的修饰是生物体内常见的翻译后修饰之一，常见的N端乙酰化与信号肽剪切与蛋白质的稳定性、定位及活性相关。此外，生物体内蛋白的水解是体内最常见的翻译后修饰之一，促使蛋白产生新的末端，此类过程与细胞凋亡、趋化因子加工等众多生物学过程及生理机能密切相关。末端蛋白组学的建立也大大的促进了蛋白水解酶底物鉴定及位点分析等领域的发展。但是，蛋白的末端不具有如磷酸化糖基化等修饰可进行直接富集的靶标，因为，如何有效的区分末端肽段与酶解所产生的中间肽段进而实现末端肽段的有效富集，对于了解生物过程及寻找疾病的生物标志物都将起到重要作用。

蛋白末端的富集主要分为两大类，正向富集与反向富集。反向富集方法通过氨基活性颗粒或带有标签的氨基活性试剂去除中间肽段从而得到末端肽段(Molecular&Cellular Proteomics 2012,11,832-842；Nature Biotechnology 2010, 28,281-288)。由于中间肽段难以去除完全，限制了方法的选择性；此外，此类方法需要采用大量的材料键合或吸附中间肽段，从而引起大量的非特异性吸附，而造成末端肽段的丢失。正向富集通常在蛋白末端引入亲和标签，酶解后通过亲和标签实现蛋白N端富集(Cell 2008,134,866-876；Analytical Chemistry 2013,85,6826-6832；Proceedings of the National Academy ofSciences 2009,106, 19310-19315)，此类方法避免了大量材料的非特异性吸附所引起的末端丢失，但是通常在N端引入标签的效率低，限制了方法的富集效率。

为克服以上方法所存在的问题，我们选择了效率高且简易快速的标记方法于蛋白N端引入亲和标签，以实现蛋白质N末端的高效高选择性富集。

发明内容

本发明发展了一种蛋白质N-端富集方法，标记效率高，选择性高。

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1)采用碱性磷酸酶酶切蛋白磷酸化修饰

取蛋白提取液于3000-10000Da超滤膜上，将背景溶液置换成1×蛋白金属磷酸酶(PMP)反应缓冲液(100mM氯化钠,50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸,2mM二硫苏糖醇,pH 7.5)，加入体积百分数为0.1％-1％蛋白酶抑制剂 cocktail和终浓度为0.5-5mM氯化锰,混合均匀后加入λ蛋白磷酸酶 (λ-PPase)，于25-50℃温育1-5h,得溶液A。

2)在强碱性条件下，选择性的对肽段侧链氨基进行胍基化

于超滤膜上，将溶液A进行变性、还原、烷基化后，采用氢氧化钠调节pH至9-12，加入终浓度为0.1-2M O-甲基异脲和终浓度为1-6M盐酸胍或尿素，于4-37℃振荡反应4-36h，得溶液B；

3)采用能与氨基反应且含磷酸根的试剂标记蛋白剩余的末端氨基

将溶液B的pH调节至6-9，加入终浓度为10-1000mM的磷酸根试剂，保持溶液中的尿素或盐酸胍终浓度为1-6M，于10-60℃振荡反应2-12h。将超滤膜上的溶液进行离心，采用10-100mM的碳酸氢铵进行溶液置换，以去除残余的试剂，得溶液C。