[发明专利]一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法

权利要求书

1.一种云斑尖塘鳢精子超低温保存的方法，其步骤是：

(1)云斑尖塘鳢精子的采集：选择性腺发育成熟的云斑尖塘鳢雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水；用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出精液后，用干燥的滴管吸取精液，开头3-5滴精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中，混匀；

(2)精子活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到90％以上，平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上，平均直线运动速度达到20微米/秒以上，该精子便可用于超低温冷冻保存；将镜检合格的精子放入4℃冰箱保存备用；

(3)精子的稀释：准确量取需要被冷冻的云斑尖塘鳢精液，加入精液3倍体积的精子稀释液，使精液与稀释液的稀释比达到1∶3；精液与稀释液混匀，备用；

(4)精液的冻前平衡：将稀释后的精液放入4℃冰箱，进行冻前平衡；云斑尖塘鳢精液的冻前平衡时间为15～45分钟；

(5)加抗冻剂及分装：在平衡好的云斑尖塘鳢精液中直接加入抗冻剂二甲亚砜(DMSO)，使抗冻剂在精液中的终浓度达到10％；抗冻剂加入后，立即混匀，分装至麦管；所有的管内不能留有气泡，分装过程必须在冰面完成，分装完成的管子在没有进入程序降温仪前，应全部埋在冰里；

(6)程序降温：将分装好的精液以快速放入程序降温仪的冷冻室中；云斑尖塘鳢的降温程序从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟；

(7)进入液氮：降温完成后，直接将装有精液的麦管或冷冻管取出，立即放入液氮罐中，在-196℃温度中保存。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)所用的雄鱼为云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmorata)，且体重在500克以上。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述的精子稀释液配方为：7.0g/L氯化钠(NaCl)，1g/L氯化钾(KCl)，15g/L葡萄糖(C6H12O6)；该稀释液盐度为7.3，pH为7.5；放置在4℃冰箱保存，备用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中精液的冻前平衡步骤为：将稀释后的精液放入4℃冰箱，进行冻前平衡；云斑尖塘鳢精液的冻前平衡时间为15～45分钟。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中所述的抗冻剂二甲亚砜(DMSO)在精液中的终浓度达到10％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中所述的降温程序为：从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟。

7.一种云斑尖塘鳢精子超低温保存后的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从液氮罐中取出冻精：首先在液氮表面平衡15分钟，然后用长镊子从液氮罐中取下装有冻精的麦管；在液氮罐口放置30～60秒后，准备解冻；

(2)解冻：将麦管直接放入37℃水浴中，在水浴中不断晃动麦管，10秒后见麦管内气泡可上下移动时，即说明麦管内冻精已经解冻；

(3)冻精存放与备用：将解冻后的精液集中到一个干燥的容器中，放入4℃冰箱备用；冰箱存放时间最多不超过30分钟就必须用于人工授精；

(4)人工授精：将解冻备用的3mL冻精倒入挤出的卵中，用羽毛轻轻搅匀；然后加入50mL预先配制好的精子通用激活液，轻轻搅拌3分钟，静置1分钟后，再加入500mL以上清水激活精子以达到受精，即可将受精卵移入孵化器中孵化。

8.如权利要7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)所述的精子激活液配方为：2.6g/L氯化钠(NaCl)，0.4g/L氯化钾(KCl)，2.4g/L Tris-HCl；该激活液pH为8.2，放置在4℃冰箱保存，备用。