[发明专利]一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖学领域，涉及鱼类种质保存技术，具体涉及一种云斑尖塘鳢精子超低温冷冻保存及复苏方法。

背景技术

目前，鱼类种质保存主要以精液保存为主。精子的保存可分为常温保存、低温保存以及超低温冷冻保存三种。精子的寿命随其能量的消耗殆尽而结束。其能量消耗主要在两个方面：一个是运动(摆尾游动)；第二是调节细胞内外渗透压平衡(非主动运输耗能)。因此，减缓精子的能量消耗，就可以将之寿命延长。常温保存是根据精子的生理特性，配制一定浓度的稀释液，从而减少精子用来调节渗透压平衡时的能量消耗进而延长精子的寿命，通常能够延长几十分钟至几小时之久。低温保存的原理是：低温能降低精子代谢活动(低温酶类效率降低)，通常能够延长几天至几十天。超低温保存则是让精子在超低温(-196℃)条件下，其运动和代谢几乎完全停止，精子处于类假死状态，生命以接近静止状态保存下来。精子在理想状态下能够无限期的保存，解冻后又会“复活”。

云斑尖塘鳢(Oxyeleotrismarmorata)是我国引种并养殖的名贵淡水鱼品种，由于其体形似笋壳，故俗名为笋壳鱼。该鱼原产于东南亚泰国一带，最大个体可达5～6公斤，其肉质细嫩、营养价值高、味道鲜美且刺少，是一种名贵食用鱼，在东南亚各国和港澳、台湾等地区及日本深受消费者欢迎，是这些东南亚国家大宗出口的主要淡水鱼产品。由于产地国笋壳鱼仍停留在依靠自然资源捕获养殖的水平上，无法满足市场强劲的消费需求，导致目前该商品鱼市场批发价上涨到160～200元/kg。由此可见，云斑尖塘鳢的市场前景好，是一种新兴的、高产值、高效益的水产养殖新品种。为了能进一步开展云斑尖塘鳢的新品种选育、人工繁殖以及种质保存，为市场提供更加优质的云斑尖塘鳢新品种和苗种，需要进行云斑尖塘鳢精子超低温保存和人工繁殖。然而，无论是精子的超低温保存，还是进行人工繁殖，都需要一种稀释液对云斑尖塘鳢鲜精进行稀释，而且需要一种激活液对鲜精或冻精(经超低温保存后的精子再解冻)进行激活。

云斑尖塘鳢精液中所含精子的密度很高，一般可以达到1.8×10⁹个/mL以上，当对云斑尖塘鳢精子进行超低温保存时，含高密度精子的精原液是不能直接进行超低温冷冻保存的，这是因为在冷冻过程中，当温度降到0℃～-20℃区间时，被保存的精液中会形成冰晶，冰晶像锋利的刀一样刺向四周的精子，将精子刺破，精液中的精子密度越高，精子被刺破的概率也越高，这种在冷冻过程中冰晶对精子的物理损伤将直接导致精子超低温冷冻保存的失败。因此，冷冻前必须要对精子进行稀释。而在进行云斑尖塘鳢人工繁殖时，由于精液中含精子密度很高，若不稀释就用，不仅对该鱼精液是一种浪费，而且鲜精黏稠度大，使精子不易与卵子混合均匀，从而导致授精效果也不好。如果对精液进行稀释后，再用来进行人工授精，可大大降低人工授精的成本，同时还能起到很好的授精效果，获得较高的受精率。因此，云斑尖塘鳢精子稀释液的作用就是在不激活精子的前提下，对精子进行稀释，使精子尽可能的保持其原有的生物学特性。

当精子被超低温保存时，为了提高精子的抗冻能力，除了对精液进行稀释外，还需要在稀释的精液中添加一定量的抗冻剂，如二甲亚砜(DMSO)等。由于抗冻剂具有很强的吸水性，当被添加到精液中后，可以使精子细胞内的一部分水被吸出。精子细胞的水分流失导致精子细胞内的细胞液浓度升高，精子的冰点也随之升高，从而提升了精子的抗冻能力。也正是由于精子细胞内的细胞液浓度升高，精子的渗透压也会随之升高。这样，冻精的渗透压与鲜精相比会高出30～40％。含如此高内部渗透压的冻精，如果直接用淡水激活进行人工授精，在巨大的渗透压差作用下，其冻精一遇见水就可能破裂，从而使人工授精失败。解决这一问题的办法就是用具有一定渗透压的精子激活液来替代淡水对云斑尖塘鳢冻精进行激活，以减少这种渗透压差。因此，云斑尖塘鳢精子激活液的作用就是减少这种渗透压差，使得云斑尖塘鳢冻精在激活时不会破裂，顺利实现用冻精进行该鱼的人工授精。另外，精子激活液除了减少冻精与激活液间的渗透压差，保护冻精在激活过程中不破裂的作用外，对一般云斑尖塘鳢鲜精也有使精子活力优化的作用。这是因为激活液是由不同离子或大分子物质组成的，这些离子和大分子物质对精子的运动可以起到一定的优化作用。

目前，由于环境恶化、近亲繁殖等引起的物种灭绝、种质退化、品质下降以及病害频发等现象日趋严重，超低温冷冻保存技术作为基因长期保存的有效工具逐渐成为解决这些问题的首选。此外，超低温保存技术还可以为遗传育种研究长期不断的提供精子材料，这在雌雄核发育、性别控制及以精子作为载体生产转基因生物等方面均有应用价值。