[发明专利]一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法

权利要求书

1.一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法，其步骤为：

(a)提取DNA：用单个体裂解法提取浮游动物DNA，得到单只浮游动物DNA提取液，采用的裂解液含有25mM的氢氧化钠、0.20mM的乙二胺四乙酸二钠盐、1％的SDS和0.05mg/mL的蛋白酶K的水溶液，pH值为8.0-8.5；

(b)合成MIT引物并进行PCR扩增：以步骤(a)中得到的单只浮游动物DNA提取液为模板，MIT引物进行PCR扩增，所述的MIT上游引物是由测序接头序列、barcode序列以及普通CO1上游引物依次连接组成，所述的MIT下游引物是由普通CO1下游引物及测序接头序列依次连接组成，或者由普通CO1下游引物、barcode序列及测序接头序列依次连接组成，所述的barcode序列长度为8-12bp，序列中GC碱基的含量为40-60％；

(c)PCR扩增产物纯化及定量：用割胶回收试剂盒或者PCR纯化试剂盒对步骤(b)中得到的PCR产物进行回收或纯化，用DNA定量试剂盒对DNA进行定量，纯化、定量后的PCR产物用DNA分析仪进行片段大小分析；

(d)高通量测序：用高通量测序仪对步骤(c)中纯化后的PCR产物进行高通量测序，测序结果以fastq格式输出，过滤测序质量值低和长度短的序列，根据MIT引物中的barcode序列将测序结果分为不同的样本组；

(e)序列分析：根据步骤(d)中得到的不同样本组中的序列分别进行多重序列比对，根据多重序列比对结果，依据遗传距离进行序列分组，选取每组中最长的序列作为本组的代表序列并进行BLAST注释；

(f)确定条形码序列：参考物种的分类鉴定信息，选取样品所测序列的注释信息和分类鉴定信息最接近的序列组作为本样品的条形码序列。

2.根据权利要求1所述的一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法，其特征在于：所述的步骤(b)中MIT引物的设计方法为：

(ⅰ)选取PCR上、下游引物；

(ⅱ)将高通量测序平台的测序接头A连接在PCR上游引物中得到MIT初始上游引物，将高通量测序平台的测序接头P1连接在PCR下游引物中得到MIT初始下游引物；

(ⅲ)设计不同的MIT barcode序列，长度为8-12bp，MIT barcode序列中GC碱基的含量为40-60％；

(ⅳ)将步骤(ⅲ)中设计的MIT barcode插入步骤(ⅱ)中得到的MIT初始上游引物的接头A与PCR上游引物之间得到MIT上游引物。

3.根据权利要求2所述的一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法，其特征在于：所述的步骤(ⅰ)中选取的PCR上、下游引物为细胞色素氧化酶1的上游引物mlCOlinF：5’-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3’和下游引物HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAA ARAAY CA-3’。

4.根据权利要求2所述的一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法，其特征在于：所述的步骤(ⅱ)中高通量测序的平台为Ion torrent测序平台，接头A为5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3’，接头P1为5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTC GGTGAT-3’；所述的步骤(ⅲ)中设计96条不同的MIT barcode序列。

5.根据权利要求4所述的一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法，其特征在于：所述的步骤(ⅳ)中将步骤(ⅲ)中设计的MIT barcode插入步骤(ⅱ)中得到的MIT初始下游引物的接头P1与PCR下游引物之间得到MIT下游引物。