[发明专利]一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法

说明书

本发明公开了一种利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法，属于生物技术领域。本发明设计的MIT引物由测序接头序列、8‑12个碱基的barcode序列和常规PCR引物组成；本发明中利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法包括：单个体裂解法提取DNA、线粒体DNA(MIT)引物PCR扩增、PCR扩增产物纯化及定量、高通量测序和序列分析，本方法采用特殊的MIT引物，避免了测序文库的构建，通过高通量测序可一次性的获得大量的条形码序列，操作方便，快速，经济，便于推广应用，能高效的构建各种动物条形码数据库。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种MIT引物设计方法和利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法。

背景技术

DNA条形码(DNA-barcoding)是目前最有力的物种鉴定技术之一，尤其在未知物种的鉴定中起着重要的作用。随着二代测序通量的提高和测序成本的降低，DNA条形码技术开始越来越多的应用在生物多样性调查或环境生物监测中。目前基于DNA条形码的物种鉴定都要以条形码数据库为参照，利用条形码数据库中的物种序列信息来注释待鉴定的序列，所以条形码数据库对DNA条形码而言至关重要。最早的条形码数据库生命条形码协会(Consortium for the Barcode of Life,CBOL)成立于2004年，是最早发起DNA条形码的组织之一，也是目前条形码分类的主要机构，拥有成员200多个，分布于50个国家。数据库中样本数超过八十万，物种数超过七十万种。生命条形码数据库系统(BOLD)是在线的DNAbarcode搜集、管理、分析的平台；由管理、分析系(MAS)、识别系统(IDS)和外部连接系统组成(ECS)；能对数据进行快速的识别分析。其数据库中目前的barcode序列多达二百七十多万条。NCBI的Genbank也是另一个重要的条形码数据库，包含了数百万条条形码序列。

经检索，中国专利申请公开号CN 102933721 A，申请日为2011年6月8日的专利申请文件公开了用于高通量筛选的组合序列条形码，该发明涉及至少两个核苷酸序列标识符的组合在制备用于高通量测序的样本DNA中的方法和用途，在多种制备的样本DNA的高通量测序中，样本DNA的各制备包括至少两个核苷酸序列标识符的独特组合，其中第一核苷酸序列标识符选自核苷酸序列标识符的一组，且第二核苷酸序列标识符选自核苷酸序列标识符的一组。中国专利申请公开号CN 102877136A，申请日为2012年9月24日的专利申请文件公开了基于基因组简化与二代测序DNA文库构建方法及试剂盒，该方法和试剂盒针对现有文库构建方法不足，可用于参考基因组不完善、研究群体系谱不清晰、无单体型图物种的全基因组SNP检测及基因分型，该发明涉及的DNA文库构建方法及试剂盒操作流程简单，产生的文库测序质量较高。

虽然经过十多年的积累，条形码数据库已经覆盖了大多数物种类群，但是和地球上物种数量相比还是远远不够。现在通用的条形码数据库构建都是基于一代Sanger测序，成本高、准确率低、劳动强度大。对于浮游动物而言，由于其个体较小(50-500μm)，纯DNA提取困难，DNA纯度低，往往会导致PCR产量低，由于一代Sanger测序需要的DNA量大(50-500ng)，为了满足测序的需要多数情况下需要构建专门的测序载体，通过细菌繁殖增加待测片段的产量，然后进行测序。操作繁琐，而且由于浮游动物是单个体裂解，体内的寄生菌和残留在体内的食物残渣不可避免会带来的DNA污染，PCR产物直接进行一代测序成功率低(往往会出现杂峰)，增加条形码数据库的构建的难度。即便正确测序，单个测序反应也只能得到一条序列，效率低下。为了满足日益增长的DNA条形码数据分析的需要，亟待开发一种新的方法能够快速、准确的构建条形码数据库。

发明内容

1.要解决的问题