[发明专利]诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫细胞体外培养领域，涉及诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法。

背景技术

DC是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)。近年来，以树突状细胞(dendritic cell,DC)为基础的肿瘤免疫治疗及DC疫苗已取得较大进展，体外制备的DC疫苗显示出明显诱发抗肿瘤免疫应答的能力，具有良好的临床应用前景。目前，从外周血单个核细胞(PBMC)经GM-CSF、IL-4体外诱导培养DC的方法已基本得到公认，但DC体外促成熟的方案尚没有统一的标准，国内主要采用TNF-a因子，但该方法活化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12，致使培养得到的DC功能缺陷，很大程度上限制了DC疫苗的临床应用工作的开展。因此，有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。

DC在肿瘤、感染、器官移植等领域已显示出其免疫治疗的安全性及有效性，但体内DC数量极少，故目前临床所用DC多是采集DC前体细胞经体外培养得到。DC前体细胞经不同细胞因子作用，诱导出未成熟DC(immature DC,iDC)摄取和加工抗原；然后再经不同的促成熟因子作用，生成成熟DC(mature DC,mDC)，其成熟状态决定机体免疫调节的方向。只有成熟DC才能有效呈递抗原，表达各种表面分子和共刺激分子，分泌多种细胞因子，提供三种信号活化T淋巴细胞，激活特异性细胞免疫反应，诱导Th1型免疫反应。在抗肿瘤免疫反应中，Th1免疫反应被认为在抗肿瘤免疫中发挥重要作用；而Th2以及Treg反应则被认为引起免疫耐受。在这个过程中，DC细胞分泌的促炎因子IL-12水平起了关键性的作用。高水平的IL-12被证实可有效极化Th1细胞的产生，从而辅助诱导抗原特异性的CD8+CTL细胞生成。此外，IL-12还可直接作用CD8+T细胞使其增殖，增强细胞免疫效应以及形成长久记忆性T淋巴细胞。因此，能够分泌高水平的IL-12是DC细胞生物活性高的标志之一。

现有的DC培养技术未能足够重视DC促成熟过程，同时考虑成本因素，往往仅用干扰素a作为促成熟因子。实验研究表明干扰素a促成熟DC细胞成熟度不足，表面标记表达低，促炎因子分泌低，活化免疫功能差。因此有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法。

为实现上述目的，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法。根据本发明的实施例，该方法的步骤为：将前体单核细胞用新鲜的无血清树突状细胞培养液悬浮，使细胞密度为2x10⁵-1x10⁶/ml，在37℃，5％CO₂培养箱中培养5-6天，然后加入IL-1β与TLR刺激，并于37℃，5％CO₂培养箱培养24-48小时后收获成熟的树突状细胞。

根据本发明的实施例，所述IL-1β的用量是500-10000U/ml，TLR的用量是1-50ng/ml。

根据本发明的实施例，所述IL-1β的用量为1000U/ml，TLR的用量为5ng/ml。

根据本发明的实施例，所述前体单核细胞是外周血单个核细胞。

根据本发明的实施例，所述的无血清树突状细胞培养液是含有500U/ml的GM-CSF和400U/ml的IL-4的无血清培养液。

根据本发明的实施例，所述的无血清培养液是Life Technology公司的AIM-V，或者Lonza公司的X-VIVO。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了所述方法制备得到的成熟DC细胞用于制备临床细胞治疗和肿瘤免疫治疗药物或疫苗的用途。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种组合物，由IL-1β与TLR组成，在树突状细胞培养液中，IL-1β的用量是500-10000U/ml，TLR的用量是1-50ng/ml。

根据本发明的实施例，所述IL-1β的用量是1000U/ml；TLR的用量是5ng/ml。