[发明专利]FMDV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种FDMV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）引物设计

引物序列包括一条特异性反转录引物FMDVR P0，两对特异性引物对FMDVT-F P1、FMDVT-R P2 、FMDVO-F P3、FMDVO-R P4，两条TaqMan MGB探针FMDVT-MGB-FAM-Probe Probe-P5、FMDVO-MGB-VIC-Probe Probe-P6，具体序列如下：

P0：cgggaaacgcatgagcagta，

P1：cggcctctcatccaacaga，

P2：attttccttcaggcgcttga，

P3：gcgcgctcctccgtact，

P4：cgtgtttcactgccacttctaga，

Probe-P5：5'-FAM- tcatttgtgaaacgcg -MGB-3' ，

Probe- P6：5'- VIC- ccacctactacttcgca -MGB -3'；

（2）总RNA的制备

以口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型细胞灭活病毒标准株单一培养物的等量混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，与待检样品同时采用Trizol法提取总RNA；

（3）反转录

将步骤（2）中所提取的总RNA分别进行反转录；

（4）FMDV通用型和O型标准品的制备

将含有FMDV-T基因片段和FMDV-O基因片段的阳性扩增产物分别连接入pGEM-T Easy载体，培养、鉴定，将测序正确的pGEM-T/ FMDV-T 和pGEM-T/ FMDV-O重组质粒，测定并确定质粒DNA的浓度和纯度，－20℃保存备用；

（5）口蹄疫病毒通用型和O型二重FQ-PCR反应条件  

将步骤（4）所得的pGEM-T/ FMDV-T 和pGEM-T/ FMDV-O重组质粒分别稀释作为检测模板，对照组和待检测样品分别进行荧光定量PCR反应；

（6）结果判定

阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准；

在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式下阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞40.0或无；阳性对照的Ct值应≤35.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效；

检测结果成立的前提下，若样品在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式Ct值≤35.0，而且出现两条特定的扩增曲线，表明样品中存在口蹄疫病毒并且为O型；若样品在“FAM/NONE”或“VIC/NONE”标记模式下出现Ct值≤35.0，而且出现一条特定的扩增曲线，表明样品中存在口蹄疫病毒，但不是O型；Ct值＞38.0或无，并且无特定的扩增曲线，并且阳性对照的Ct值≤35.0，则判定为阴性；

38.0≥Ct值＞35.0且有特定的扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。

2.如权利要求1所述FDMV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤（5）中的PCR反应体系为：

P1引物，20μM、0.5μL； 

P2引物，20μM、0.5μL；

P3引物，20μM、0.5μL；

P4引物，20μM、0.5μL；

Probe-P5，10μM、0.6μL；

Probe-P6，10μM、0.8μL；

dNTPs，2.5 mmol/L、2 μL；

10×Ex Taq 缓冲液，2.5 μL；

Ex Taq酶，5U/μL 、0.25 μL；

1.0×10⁶拷贝/μL的质粒模板，2 μL；

反应体系，25μL；

反应程序：94℃，5 min，94℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。