[发明专利]FMDV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体涉及一种FMDV（口蹄疫病毒）通用型和O型二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法。 

背景技术

口蹄疫( Foot and Mouth Disease，FMD) 是由口蹄疫病毒( Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)引起的以偶蹄动物为主的口腔粘膜、四肢下端和乳房等处皮肤发生水泡和溃烂为典型临床特征的一种热性、急性、烈性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其列为A 类动物传染病之首，我国也将其列为一类动物传染病首位。其发病特征是传播途径多，传播速度快，传染性强，病原变异大，危害严重，因此曾多次在世界上引起流行。该病的暴发和流行常常给畜牧业生产和经济发展造成巨大的损失，主要是由于患病动物死淘率增加、生产性能下降、种用价值丧失，更重要的是任何国家和地区都不与有口蹄疫国家进行贸易往来，严重影响了经济贸易与畜牧业的发展，并造成相关的政治、经济和社会问题，因而倍受世界各国的关注。随着我国规模养殖业的不断发展，口蹄疫传播的风险越来越大，加之流行毒株血清型的不断改变，使得口蹄疫控制难度不断加大，所以目前有效控制口蹄疫发生的主要措施仍然是免疫接种和综合预防。

口蹄疫最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等；黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。本病以牛最易感，羊的感染率低。从流行特点来看，羊是FMDV的储存器，猪是感染的放大器，牛是发病的指示器，牛、猪、羊感染后，症状最明显的是牛、最不明显的是羊，而感染后排毒最强的是猪，其呼出的气体中FMDV是牛的20倍。该病传染快、流行广、发病率高，往往牛、羊、猪在同一时间内发病。近年来，猪发生有扩大的趋势，特别是O型口蹄疫。

口蹄疫病毒在环境中有很强的抵抗力，一有机会就会侵入动物机体复壮，并迅速扩增，因此环境的污染也可造成该病的传播，如污染的水源、棚圈、工具和接触过病畜人员的衣物、鞋帽等。口蹄疫是变异性很强的病毒，病毒突变株的广泛存在以及感染宿主的广泛性和环境因素的复杂性，使疫情的暴发往往不可预测并且难以控制。

FMDV分O型、A型、C型、南非1型（SAT1）、南非2型（SAT2）、南非3 型（SAT3）、亚洲Ⅰ型 (AsiaⅠ型)7 个血清型，各主型又分若干亚型，各主型之间无交叉免疫性，且可在不同种动物间传播，同一主型内的不同亚型之间也只有部分有交互免疫性。在欧洲流行的FMDV主要是O型，南美州以O型、A型和C型为主，亚洲则以O型、A型、C型和Asia I为主型，然而FMDV的7种血清型中有6种流行于非洲，即O、A、C、SAT1型、SAT2型及SAT3型，并且SAT1型和SAT2型偶尔会从非洲侵入到中东国家。目前，我国流行的FMDV以O型和AsiaⅠ型为主，A型在我国新疆、上海等地区也曾有流行。O型FMDV目前共存在9个拓扑型，古典中国型(Cathay)，中东南亚型(ME-SA)，东南亚型(SEA)，欧洲南美型(Euro-SA)，印度尼西亚1型(ISA-1)，印度尼西亚2型(ISA-2)，东非1型(EA-1)，东非2型(EA-2)和西非型(WA)。当前我国主要流行三种遗传拓扑型（Topotype）的O型口蹄疫病毒，分别属于CATHAY型（中国型）、ME-SA型（中东-南亚型）和SEA型（东南亚型）。

目前已有的Asia I型FMD用液相阻断ELISA、O型FMD用正向间接血凝试验或液相阻断ELISA、非结构蛋白（NSPs）间接ELISA等血清学方法只能评价口蹄疫单一血清型抗体水平。国内也有研究者建立了针对口蹄疫病毒O型、A型与AsiaⅠ型三重RT-PCR检测方法，但RT-PCR方法作为动物疫病病原学检测方法虽然具有较快速、特异的特点，但需要制胶、电泳等后续鉴定工作，操作复杂，而且增加了该方法对实验室的污染，因而尚待继续改进。 

发明内容

本发明针对通用型（T型）和O型FMDV序列设计了新的引物和探针，提供了一种FMDV通用型和O型的二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法，经过一个PCR反应即可同时对通用型和O型FMDV核酸进行快速、特异、敏感的检测，在确定是否为FMDV感染的同时，又能确定是否是O型FMDV感染，该方法不需要电泳鉴定，能够简化操作，而且具有快速、特异、敏感性高的优点。