[发明专利]FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法

权利要求书

1.一种口蹄疫病毒通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）引物设计

引物包括共用的反转录引物P0，口蹄疫病毒通用型的特异性引物对P1/P2及荧光探针Probe-P5，口蹄疫病毒Asia 1型特异性引物对P3/P4及荧光探针Probe-P6，引物序列如下所示：

引物P0：5'-cgggaaacgcatgagcagta-3'，

引物P1：5'-cggcctctcatccaacaga -3'，

引物P2：5'-attttccttcaggcgcttga -3'，

引物P3：5'-aagagcacccaaacccttga-3'，

引物P4：5'-gccccgaccagtgtgtgt-3'，

探针Probe-P5：5'-FAM-tcatttgtgaaacgcg -MGB-3' ，

探针Probe- P6：5'-NED- ctcatgcagatcccct -MGB -3'；

（2）总RNA制备

以口蹄疫Asia 1型灭活疫苗为阳性对照，正常BHK-21细胞培养物为阴性对照，与含有口蹄疫病毒的待检样品同时采用Trizol法提取总RNA；

（3）反转录

对步骤（2）中提取的总RNA进行反转录，反转录产物－20℃冻存备用；

（4）通用型和Asia 1型标准品的制备

将口蹄疫Asia 1型灭活疫苗用常规RT-PCR方法分别扩增通用型和Asia 1型，并将阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中；确定测序正确的通用型和Asia 1型重组阳性质粒的浓度和纯度，－20℃保存备用； 

（5）通用型和Asia 1型二重FQ-PCR反应 

以步骤（4）所得的pGEM-T-通用型和pGEM-T-Asia 1型阳性重组质粒作为检测模板，进行二重FQ-PCR；

（6）结果判定

在“FAM/NONE”和“NED/NONE”标记模式下阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞35.0或无，阳性对照的Ct值应≤32.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效；

在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct值≤32.0，而且出现两条特定的扩增曲线，判定为阳性，表明样品中存在口蹄疫Asia 1型病毒；Ct值＞35.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性，表明样品中无口蹄疫病毒；35.0≥Ct值＞32.0且有特定扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，结果为阴性者判定为阴性；对可疑样品重新试验，结果再为可疑者应重新采集该动物样品重新试验；

在检测结果成立的前提下，若在“FAM/NONE” 标记模式下样品Ct值≤32.0，而且出现特定的扩增曲线，在“NED/NONE” 标记模式下样品Ct值＞35.0或无，且无特定的扩增曲线，判定为通用阳性，表明样品中存在口蹄疫病毒，但非Asia 1型病毒。

2.如权利要求1所述口蹄疫病毒通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法，其特征在于，步骤（5）中检测模板pGEM-T-通用型和pGEM-T-Asia 1型阳性重组质粒浓度为1.0×10⁵拷贝/μL，FQ-PCR反应体系及反应条件为：

P1/P2、P3/P4，浓度均为20μmol/L，各0.5 μL；

Probe-P5，20μmol/L、1 μL；

Probe-P6，20μmol/L、1.2 μL；

dNTPs，2.5 mmol/L、2 μL，

10×Ex Taq 缓冲液，2.5 μL，

Ex Taq酶，5U/μL，0.25 μL，

步骤（3）中反转录产物，4 μL； 

去离子水补至 25 μL；

反应条件为：94℃ 5 min后，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。