[发明专利]FMDV通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒（FMDV）通用型和Asia 1型二重TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法。 

背景技术

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD) 是由口蹄疫病毒( Foot and Mouth Disease Virus， FMDV)引起的以偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染病，我国规定为一类动物疫病。

口蹄疫病毒能使多种动物患病，主要侵害偶蹄兽，以牛最易感，其次是猪，再次为绵羊、山羊和骆驼等动物。口蹄疫传播速度快，范围广，呈蔓延式、跳跃式发展，一般呈地方流行性，也可形成周期性大流行。自然状态下，数个感染性病毒颗粒即可引起牲畜发病，疫区发病率可达50～100％，幼畜死亡率较高，其他成年动物则较低。牲畜感染口蹄疫后，会造成牲畜休食量下降，机体抵抗力和免疫力降低，容易继发其他病毒性疾病和细菌性疾病，从而造成感染动物的生产性能严重下降。随着我国规模养殖业的不断发展，口蹄疫传播速度越来越快，范围也在不断扩大，加之流行毒株血清型的不断改变，使得口蹄疫控制难度不断加大。目前，我国每年均花费大量人力、物力和财力进行防控，但该病每年仍然时有发生。

口蹄疫病毒有7个血清型， O型、A型、C型、南非1型、南非2型、南非3 型、Asia 1型(亚洲Ⅰ型)，从口蹄疫参考实验室对疫情通报统计，O 型的流行最为广泛（世界范围内），其次为AsiaⅠ和A 型，C 型和南非3型非常罕见，通常只在特定区域流行。目前我国已有猪、牛感染O 型和Asia 1型口蹄疫的病例，且 AsiaⅠ型口蹄疫流行呈上升趋势，给我国养殖业带来巨大危害。

快速、准确的诊断是控制口蹄疫疫情蔓延和追踪疫源的重要环节。它可使一线防疫人员在疫情暴发时对现场做出正确的诊断，及时确定病原、切断传播途径、采取有效的防范措施。目前已有的Asia 1型口蹄疫用液相阻断ELISA方法只能评价该血清型抗体水平。RT-PCR诊断方法具有快速、特异、敏感等优点已在疫病病原学诊断中得到广泛应用，成为动物疫病病原学快速诊断方法之一。尽管国内已有研究者建立了针对O型、A型与Asia 1型的单一血清型口蹄疫RT-PCR诊断方法，但不能同时对口蹄疫检测和分型，因而存在继续改进的空间。 

发明内容

本发明目的在于提供一种口蹄疫病毒通用型和Asia 1型二重TaqMan MGB 荧光定量RT-PCR检检测方法，该方法在对口蹄疫病原进行快速检测同时，可以同时进行分型诊断，便于有针对性的采取防控措施。

本发明针对口蹄疫病毒通用型和Asia 1型，设计了共同的反转录引物，同时设计了两对特异性的PCR引物和两条特异性的TaqMan MGB探针，建立了一种口蹄疫病毒通用型和Asia 1型二重TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法，同时优化了反应体系组分、反应条件。采用本发明，经过一个PCR反应能即可同时对口蹄疫病原进行检测及Asia 1型分型鉴定，具有较好的便捷性特点，对于临床上口蹄疫病毒通用型及Asia 1型快速鉴别诊断具有较好的实用价值。下面对本发明的技术方案进行详细说明。

一种口蹄疫病毒（FMDV）通用型和Asia 1型二重荧光定量检测方法，包括以下步骤：

（1）引物设计

经大量比对GenBank中口蹄疫病毒通用型和Asia 1型全基因序列，选择口蹄疫病毒通用型和Asia 1型高度保守的2B基因为模板，设计了共用的反转录引物P0，根据FMDV VP1保守基因序列设计通用的特异性引物对（P1/P2）及荧光探针Probe-P5，根据Asia 1型特异性VP1基因序列设计特异性引物对（P3/P4）及荧光探针Probe-P6，引物序列如下所示：

引物P0：5'-cgggaaacgcatgagcagta-3'，

引物P1：5'-cggcctctcatccaacaga -3'，

引物P2：5'-attttccttcaggcgcttga -3'，

引物P3：5'-aagagcacccaaacccttga-3'，

引物P4：5'-gccccgaccagtgtgtgt-3'，

探针Probe-P5：5'-FAM-tcatttgtgaaacgcg -MGB-3' ，

探针Probe- P6：5'-NED- ctcatgcagatcccct -MGB -3'；