[发明专利]一种从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取纯化SOD的方法，尤其涉及一种从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法。

背景技术

超氧化物歧化酶（SOD），是英文Superoxide Dismutase的缩写，是体内对抗自由基的第一道防线。当我们身体吸入氧气进行新陈代谢，就会产生超氧阴离子自由基，若不予以消除，会在体内产生连锁反应破坏细胞。正常情况下，体内自由基的产生和清除处于动态平衡。SOD在年轻人的血液中很多，人们过了30岁以后，人体内的“SOD”随着人体组织的老化而产生率逐渐降低。由于体内的SOD随着年龄的增加而渐减，再加上环境的恶化，大量的自由基超过身体所能应付的程度，因此借助外来的补充是必需的。

SOD的来源极为广泛，目前已从细菌、真菌、藻类、鱼类、昆虫、植物和哺乳类动物等各种生物体分离得到。国内已开发的SOD资源有：动物血液（牛、猪等），菌类发酵（酵母菌、大肠杆菌等），高等植物（藻类、刺梨等）等。动物提取SOD的主要原料可以是各种哺乳动物血液、肝脏、脑等，然而一些人畜共患病的原因使得许多国家禁止在食品、化妆品、医疗等领域使用动物来源的SOD。

相对于植物来源的SOD，微生物来源的SOD具有比活力高，含量高的优点，微生物的生长也远远快于植物，此外，各种微生物技术属国家重点支持行业，目前也发展迅速，这些因素都对微生物来源的SOD实现产业化具有重大的推动作用。例如，专利号为2011100503115报道了一种用大肠杆菌生产重组人源SOD的方法，但是这个专利集中在重组大肠杆菌的构建，并未公开SOD纯化方法，而从细胞内获取SOD时更是采用超声法，不适合大规模工业化生产；又如专利号为201310103919.9报道了一种酿酒酵母菌株及其在制备耐热超氧化物歧化酶中的应用，这项专利主要集中在酿酒酵母菌种的筛选以及发酵上，对于SOD的纯化并未深入研究；再如，专利号为2011103369936的专利中，公布了一种从酿酒酵母中同时提取S-腺苷-L-甲硫氨酸和SOD的方法，然而这种方法纯化的SOD纯度较低，而且在破壁时采用有机溶剂法，纯化时也采用丙酮沉淀法，这对于环境有一定的污染，也使得SOD酶活有一定得损失。目前，可以通过在重组蛋白上加上标签（例如His标签或GST标签），在微生物发酵、细胞裂解后，通过亲和层析得到较高纯度的蛋白。然而，这种带标签的蛋白存在纯化成本高、纯化结束后标签的切除等后续工艺，使得纯化过程变得昂贵，工艺也变得复杂。专利号为200810061168.8的专利中，报道了从重组大肠杆菌中提取耐高温超氧化物歧化酶的方法，由于该专利产品为耐高温SOD，因此需用80℃水浴处理细胞，用有机溶剂——乙醇沉淀，但是这对于人源SOD的酶活损害极大，最后透析也会影响工艺工业化时的放大。因此这项工艺并不适合人源SOD纯化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、可实现工业化大生产的从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法，并且所提取纯化的SOD具有较高活性。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：本发明从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法包括下述操作步骤：

1）菌体收集：采用离心法收集湿大肠杆菌细胞；

2）菌体匀浆：将上述大肠杆菌细胞中加入2~30倍体积的水，搅拌使大肠杆菌均匀分散为悬浮液，用高压均质机在100~1500bar匀浆2~8次；

3）粗酶液制备：向匀浆后产物加入pH7~9的聚醚酰亚胺溶液，使聚醚酰亚胺的终浓度为0.5~25g/L；搅拌均匀后加入硅藻土，硅藻土的加入量为每升100~300克；混合均匀后用板框过滤器过滤收集滤液，即为SOD粗酶液；

或将匀浆后产物以10000~16000rpm离心，上清液用陶瓷膜微滤系统过滤得到SOD粗酶液；

4）超滤：将上述SOD粗酶液用1000~40000 Da超滤膜处理，超滤膜两侧压力不大于0.4MPa；

5）层析：将上述超滤后所得滤液通过阳离子层析柱层析，用去离子水冲洗后用5~70mM的pH4.0~9.0磷酸缓冲溶液进行洗脱，收集富含SOD的洗脱液；所述阳离子层析柱选自Q-sepharose或DEAE-sepharose层析填料；

6）脱盐：将上述富含SOD的洗脱液通过超滤或凝胶排阻层析脱盐。

进一步的，本发明通过重复步骤4）和5）2~5次获得高纯度的富含SOD的洗脱液。

进一步的，本发明步骤2）中所述水的温度为1~15℃。

进一步的，本发明步骤5）中所述磷酸缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液。